JNK-IN-8作为JNK信号通路不可逆抑制剂在治疗骨吸收相关疾病的机制和作用
发布时间：2020-06-29 16:37
【摘要】：研究目的:骨破坏相关活动可导致骨骼疾病的发生,这类疾病是一种退化性疾病,此类疾病的特征是破骨细胞的数量增加以及活动的增强,进而导致软骨的下方骨质的破坏丧失和软骨的逐渐退化。通过将破骨细胞的分化增殖抑制,可以阻滞软骨的下方骨的丧失,JNK信号通路通过调节破骨细胞的增殖以及功能来影响骨丧失类疾病的发生。JNK-IN-8作为被发现的第一种不可逆的JNK信号通路抑制剂,在本次研究中我们进行一系列体内及体外试验来评估其对破骨细胞的形成过程中增殖和分化的影响,以及对骨的保护以和对于骨关节炎的潜在的治疗作用。研究方法:在体外实验中1.通过CCK-8法对不同浓度(0,0.125,0.25,0.5,1,2 μM)JNK-IN-8干预不同时间(48h)的骨髓间充质干细胞进行生存分析,寻找合理的药物浓度;2.在体外利用RANKL诱导髓间充质干细胞及RAW264.7细胞形成破骨细胞体系,通过TRAP染色进行计数以及统计学评价JNK-IN-8对OCs形成和生存的影响。3.应用Real-Time PCR技术检测JNK-IN-8对于RANKL诱导的BMMs细胞相关基因TRACP、CTR、NFACT、TAP、ACP5、CTSK的影响;4.应用Western blot方法验证JNK-IN-8对于MAPK信号通路下游JNK信号通路下游的磷酸化的影响。在体内实验中:1.建立c57小鼠的去卵巢骨质疏松模型;2.将建模验证成功后的c57小鼠分为4组,分别是OVX对照组、JNK-IN-8刺激低剂量组、JNK-IN-8刺激高剂量组、唑来膦酸盐刺激的sham组,进行相应处理。3两月后取胫骨进行Micro-CT扫描分析,应用Real-Time PCR技术检测胫骨。实验结果:1.细通过胞生存分析我们发现药物浓度为2 u M JNK-IN-8干预48h后抑制率约50%,(F=9.95,P0.01),本次试验中其他浓度的JNK-IN-8对于破骨细胞前体细胞(骨髓间充质干细胞)48h生存无明显影响;2.通过TRAP染色发现0.25 μ M、0.5 μM和1 u M JNK-IN-8能显著抑制体外RANKL诱导的OCs形成,1 μ M 能明显抑制 OCs 生存(F=91.08,P0.01);3.Real-Time PCR 发现 JNK-IN-8呈剂量依赖性抑制 RANKL 诱导的 TRACP、CTR、NFACT1、CTSK;4.Western blot检测JNK-IN-8(1μM)抑制JNK磷酸化以及JNK-1/2/3,JNK-IN-8能显著抑制JNK相关分子;5.对于c57小鼠OVX模型处理后发现,JNK-IN-8能抑制去卵巢c57小鼠的骨质疏松的进展;6.对小鼠的骨组织应用Real-Time PCR技术验证发现RANKL诱导而成的破骨细胞相关基因有抑制作用。实验结论:1.JNK-IN-8能抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞以及BMMSc分化形成破骨细胞,并抑制其破坏骨质的能力。2.JNK-IN-8通过抑制JNK酸化,下调OCs相关基因表达,抑制RANKL诱导的OCs活化。3.JNK-IN-8能抑制c57小鼠OVX模型中骨质的吸收和骨质疏松的发生。4.JNK-IN-8可作为潜在药物被使用在的骨丧失相关疾病的抑制剂治疗方案中。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681
【图文】：
在药物试验中，我们为了排除因为药物自身的毒性所产生的假阳性效果，研究了逡逑ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制剂０－２邋ｙ邋Ｍ浓度间对于破骨细胞的前体细胞例如ＢＭＭｓ细胞以及逡逑ＲＡＷ２６４．邋７细胞在４８ｈ的毒性作用。由图２可见ＪＮＫ－ＩＮ－８对于ＢＭＭｓ细胞及逡逑ＲＡＷ２６４．邋７细胞４８ｈ内，只有在浓度为２邋ｙ邋Ｍ时细胞生存率在５０％（＊＊Ｐ〈邋０．邋０１）。逡逑１４逡逑
同时间内表达量是下降的。为了进一步证明ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制作用，ＢＭＭｓ细胞在不逡逑同浓度的ＪＮＫ－ＩＮ－８（（０，０．２５，邋１邋ｙＭ）下刺激相同的５天，发现随着药物浓度提升，逡逑其分化后的生理活动相关基因表达量是下降的（图４）。进而说明了邋ＪＮＫ－ＩＮ－８逡逑抑制了邋ＲＡＭＬ诱导下的破骨细胞中破骨相关活动的目的基因的表达。这与前文中逡逑发现ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制ＯＣｓ活性结果一致，揭示其机制可能并从基因水平提示其与抑逡逑制破骨细胞分泌表达的ＴＲＡＰ，邋ＣＴＳＫ，以及ＣＴＲ有关。逡逑ＴＩ＾ＡＰ逦ＣＴＲ逦ｋｆ逦ＣＴＳＫ逡逑Ｃ邋３８＾逦Ｃ逡逑ｆ逦｜邋ｆｌｉ逦ｉ逡逑｜＿ＣＷ逦Ｘ逦§逦~J邋Ｃｏｏ逦遂：逦ｇ邋你邋＿Ｃ0ｎ逡逑ｒ邋Ｉ邋ｉ逦１逦－邋╁义希桑澹
本文编号：2734087
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681
【图文】：
在药物试验中，我们为了排除因为药物自身的毒性所产生的假阳性效果，研究了逡逑ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制剂０－２邋ｙ邋Ｍ浓度间对于破骨细胞的前体细胞例如ＢＭＭｓ细胞以及逡逑ＲＡＷ２６４．邋７细胞在４８ｈ的毒性作用。由图２可见ＪＮＫ－ＩＮ－８对于ＢＭＭｓ细胞及逡逑ＲＡＷ２６４．邋７细胞４８ｈ内，只有在浓度为２邋ｙ邋Ｍ时细胞生存率在５０％（＊＊Ｐ〈邋０．邋０１）。逡逑１４逡逑
同时间内表达量是下降的。为了进一步证明ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制作用，ＢＭＭｓ细胞在不逡逑同浓度的ＪＮＫ－ＩＮ－８（（０，０．２５，邋１邋ｙＭ）下刺激相同的５天，发现随着药物浓度提升，逡逑其分化后的生理活动相关基因表达量是下降的（图４）。进而说明了邋ＪＮＫ－ＩＮ－８逡逑抑制了邋ＲＡＭＬ诱导下的破骨细胞中破骨相关活动的目的基因的表达。这与前文中逡逑发现ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制ＯＣｓ活性结果一致，揭示其机制可能并从基因水平提示其与抑逡逑制破骨细胞分泌表达的ＴＲＡＰ，邋ＣＴＳＫ，以及ＣＴＲ有关。逡逑ＴＩ＾ＡＰ逦ＣＴＲ逦ｋｆ逦ＣＴＳＫ逡逑Ｃ邋３８＾逦Ｃ逡逑ｆ逦｜邋ｆｌｉ逦ｉ逡逑｜＿ＣＷ逦Ｘ逦§逦~J邋Ｃｏｏ逦遂：逦ｇ邋你邋＿Ｃ0ｎ逡逑ｒ邋Ｉ邋ｉ逦１逦－邋╁义希桑澹
本文编号：2734087
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