组织诱导性细胞外基质水凝胶制备及成骨成血管活性实验研究

发布时间：2020-06-30 16:40

【摘要】：目的以小肠粘膜下层(SIS)和脱钙骨基质(DBM)为基材,制备组织诱导性可注射细胞外基质水凝胶,探究其制备过程和方法、成胶的理化性质及水凝胶生物活性,并研究其体内外的生物相容性和成骨成血管活性。方法采用不同方法制备SIS,分别应用DNA含量、蛋白组学、扫描电镜等方法检测并比较三种方法对SIS脱细胞程度及成分、结构的影响;采用改良Urist法制备DBM,并检测其脱细胞程度和成分构成;将SIS和DBM颗粒充分溶解于含胃蛋白酶的酸性溶液中制备细胞外基质(ECM)溶液,通过调节p H和温度使其自组装形成合适浓度的SIS、DBM和SIS/DBM复合水凝胶材料。检测水凝胶成胶动力学和流变学;扫描电镜观察水凝胶材料微观形貌。将不同种类的ECM水凝胶与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养,通过死活染色、CCK-8检测水凝胶材料的细胞相容性和细胞增殖活性,通过茜素红染色、ALP活性、成骨相关蛋白基因等方法检测其成骨分化能力,RT-PCR检测成血管相关蛋白基因表达水平验证其成血管活性。将不同种类的ECM水凝胶注射至大鼠背部皮下,设置组别为SIS组、DBM组、DBM/SIS组和ColⅠ组。在术后7天处死5只动物,通过HE、Masson和CD31免疫组化染色检测水凝胶材料的生物相容性、成血管活性;制备大鼠5mm颅骨缺损模型,设置组别为SIS组、DBM组、DBM/SIS组和ColⅠ组。分别在术后4周、8周各处死5只动物,通过HE、Masson和免疫组化染色以及Micro CT检测水凝胶材料诱导骨缺损再生修复能力。结果三种方法制备的SIS和DBM,行HE和DAPI染色均无肉眼可见的细胞核,残存DNA含量分别为43.25 ng/mg、21.01 ng/mg、15.69 ng/mg和24.53 ng/mg ECM干重。ECM结构在脱细胞之后均呈现出不同成分的破坏,可见胶原纤维排列凌乱,且有断裂现象。蛋白组学显示:SIS-1、SIS-2、SIS-3和DBM中检测出的蛋白种类分别为644、717、135和129种。以胶原蛋白的种类最多,共有21个亚型,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、14、16型胶原蛋白,以Ⅰ型胶原的相对表达量最大。其中,Ⅳ、Ⅵ和14型胶原蛋白为SIS所特有,而Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ型胶原蛋白为DBM所特有。除胶原蛋白之外,纤维粘连蛋白(fibronectin)、蛋白多糖、VEGF、FGF、TGF-β和BMP-2也均检测出表达。SIS与细胞共培养表现出良好的细胞相容性。将ECM溶解之后,通过调节p H和温度,成胶动力学显示所有类型的水凝胶均能在1h内成胶,SIS/DBM复合凝胶成胶时间最短。流变学检测显示SIS、DBM和SIS/DBM凝胶材料的储存模量分别为40.33±0.57 Pa、401.67±1.46 Pa和487±6.08 Pa。SEM显示DBM和SIS/DBM凝胶材料呈现出纳米胶原纤维交错分布,随机排列,具有良好的孔隙率和三维支架结构,SIS凝胶为多孔结构,未见明显纳米纤维。死活染色提示水凝胶材料具有良好的细胞相容性。CCK-8提示水凝胶对于BMSCs增殖具有促进作用。茜素红染色和ALP活性检测提示水凝胶材料能提高ALP活性并能促进成骨分化,以DBM/SIS复合水凝胶最为显著;RT-PCR结果显示与SIS、SIS/DBM凝胶共培养的HUVEC表达KDR、Notch1和Ang2显著高于DBM凝胶,具有统计学差异。ECM水凝胶皮下注射实验显示,所有ECM水凝胶均具有良好的注射性,HE、Masson染色可见SIS和DBM/SIS凝胶组新生血管较为明显,且CD31免疫组化染色可见明显的新生毛细血管分布;DBM组有少量新生血管,ColⅠ组未见血管形成,后两者与前两者有明显的统计学差异;所有组别均未见明显异位成骨迹象。大鼠颅骨缺损修复实验中,Micro CT定量检测结果显示SIS、DBM、SIS/DBM和ColⅠ凝胶在4周和8周的BV/TV分别为29.2%、41.8%、66.32%和6.53%以及39.06%、56.5%、88.4%和8.9%。SIS/DBM复合凝胶的修复效果明显好于其他三组,有显著的统计学差异。HE、Masson染色显示SIS/DBM复合凝胶中可见明显的新骨形成,DBM组次之,两者均明显强于SIS凝胶和ColⅠ凝胶,8周时修复效果明显好于4周;ALP和OCN免疫组织化学染色结果显示SIS/DBM复合凝胶组和DBM凝胶中,ALP和OCN高度表达,明显高于SIS凝胶和ColⅠ水凝胶组。结论经过适当脱细胞方法制备的SIS和DBM,可保留其大部分天然细胞外基质(ECM)的结构和活性成分。ECM酸溶液经调节p H和温度后可制备可注射水凝胶,具有良好的理化特性、生物相容性和成血管及成骨诱导活性,能原位诱导血管形成和新生骨形成,促进骨缺损再生修复,可作为一种良好的组织诱导性生物材料。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08;R68
【图文】：

实验仪器,离心管,提取液,成分检测

（1）配制浓度分别为 0、18.75、37.5、75、150、300ng/mL 的 DNA 标准品溶00μL。（2）从实验 4.1（9）中所得的 DNA 提取液中，提取 20μL 至 1.5mL 离心管中入 380μL 的 TE 溶液，充分吹打混匀。（3）取 37.5μL Picogreen 染液加入 10mL 离心管中，然后加入 7462.5μL 的液，充分吹打混匀。（4）取 100μL DNA 溶液提取液放置酶标板中，加入 100μL 稀释后的 Picogr液，混合均匀后，避光反应 5min，测定荧光强度（激发波长 480nm，发射波长20nm）。. SIS 和 DBM 成分检测应用蛋白组学方法来分析三种方法制备的 SIS 和 DBM 含有的所有蛋白。采用记定量蛋白质组学（label free）实验方法进行所有样品的检测。具体操作步骤如.1 实验仪器和数据分析软件

试剂,实验方法,丙酮,超声粉碎

23图 1-2 蛋白组学检测使用的试剂和耗材验方法品制备方法用 TCA/丙酮沉淀+SDT 裂解法：取适量样本在液氮中用磨碎成细粉状的 TCA/丙酮（1:9），涡旋振荡器混匀，置于-20℃冰箱中沉淀 4h 以上。 6000g 的转速离心 40min，弃上清。加入预冷丙酮，洗涤三次。通风橱称取 30mg 干燥后的粉末，加入 30 倍体积（质量体积比）的 SDT 裂解液淀，沸水浴 5 分钟。使用超声粉碎仪粉碎，再次沸水浴 15 分钟。以 14心 15 分钟。收集上清液过滤（0.22μm 滤膜）并收集滤液。蛋白质定量

【参考文献】