负载miR-126的外泌体对大鼠早期激素诱导的缺血性股骨头坏死的治疗作用

发布时间：2020-07-07 23:41

【摘要】：目的探讨负载miR-126的骨髓间充质干细胞(Bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosomes)对早期激素诱导的缺血性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH)的治疗作用。方法体外实验,采用超速离心法分离提纯BMSCs分泌的外泌体(MSC-Exo)以及micrON?miRNA-126 mimic转染的BMSCs分泌的外泌体(miR-126-MSC-Exo),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其miR-126相对含量。将生长良好的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分为3组:miR-126-MSC-Exo组、MSC-Exo组和对照组,分别以miR-126-MSC-Exo、MSC-Exo及等体积PBS进行处理,通过MTT、划痕实验以及成管实验分别观察各组细胞增殖、迁移和毛细血管网的形成情况,Western blot检测各组HUVECs中spred1、血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达情况。在体实验,脂多糖(LPS)及甲泼尼松龙(MPS)注射构建大鼠SANFH模型,将SANFH大鼠分为3组:miR-126-MSC-Exo组、MSC-Exo组和对照组,鼠尾静脉分别注射miR-126-MSC-Exo、MSC-Exo及等体积PBS,6周后,CD31免疫荧光染色观察股骨头血管数量,HE染色及micro-CT扫描观察骨质情况,以评估负载miR-126的外泌体对大鼠早期SANFH的治疗作用。结果体外实验结果显示:miR-126-MSC-Exo中miR-126相对含量显著高于MSC-Exo。miR-126-MSC-Exo组HUVECs的增殖、迁移和成管能力显著高于MSC-Exo组(P0.05),spred1表达水平较MSC-Exo组显著降低、而VEGFA的表达水平显著升高(P0.05)。在体实验结果显示,miR-126-MSC-Exo组大鼠股骨头坏死区CD31免疫荧光标记的数量较MSC-Exo组显著增多(P0.05),HE染色结果显示与MSC-Exo组和对照组相比,miR-126-MSC-Exo组小梁组织排列规则,骨细胞空陷窝率明显降低(P0.05),对照组中小梁结构紊乱骨细胞空陷窝率明显高于miR-126-MSC-Exo组和MSC-Exo组,骨髓颗粒细胞和脂肪组织也明显增多。股骨头坏死区micro-CT扫描显示miR-126-MSC-Exo组的小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、小梁数(trabecular number,Tb.N)和单位组织体积骨量(bone volume per tissue volume,BV/TV)显著高于MSC-Exo组和对照组(P0.05),而小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)显著降低(P0.05)。结论负载miR-126的外泌体通过增强血管新生、促进成骨治疗大鼠早期SANFH。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.8
【图文】：

相对含量,统计学意义

1 miRNA-126-MSC-Exo 和 MSC-Exo 中 miRNA-126 的相对RNA-126-MSC-Exo 中的 miR-126 相对含量显著高于 MSC-Exo 组；*表示 P差异有统计学意义光定量PCR检测miRNA-126-MSC-Exo 和MSC-Exo中miR的相对含量（n=3, x±s）miRNA-126-MSC-Exo 组 MSC-Exo 组26-3p 0.85±0.03 0.15±0.05*示 P<0.05，差异有统计学意义外泌体的鉴定和分析射电镜扫描提纯的 MSC-Exo，其形态大多为杯形或圆形结构0~100nm 之间（图.2A）。倒置荧光显微镜下观察 DiL 标记的 MCs 摄取，且其主要集中在细胞核附近（图.2B）。Western bl

透射电镜,透射电镜,增值率,统计学意义

图 2 透射电镜及 Western Blot 鉴定和分析 MSC-Exo注：A: 透射电镜观察外泌体的形态 (×40000); B: HUVECs 细胞摄取外泌体 (×400); C:Western blotting 检测外泌体 CD9, CD63 and CD81 蛋白表达（三）miRNA-126-MSC-Exo 促进 HUVECs 增殖、迁移和成管1、MTT 实验结果显示：24h 时 HUVECs 的增值率在 miR-126-MSC-Exo 组 HUVECs 的增值率显著强于 MSC-Exo 组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图 3、表 2。

透射电镜,增殖率,增值率,统计学意义

图 2 透射电镜及 Western Blot 鉴定和分析 MSC-E电镜观察外泌体的形态 (×40000); B: HUVECs 细胞摄取外泌体 (×Western blotting 检测外泌体 CD9, CD63 and CD81 蛋白表达miRNA-126-MSC-Exo 促进 HUVECs 增殖、迁移和成管实验：24h 时 HUVECs 的增值率在 miR-126-MSC-Exo 组 HUVECs SC-Exo 组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图 3、表

【参考文献】