肿瘤坏死因子-α通过NF-κB通路促进MSCs在氧化应激环境中的存活及迁移以防治移植静脉内膜增生

发布时间：2020-07-13 12:33

【摘要】：研究背景:冠心病是目前严重危害公众健康的具有高发病率的一类疾病,冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)以心肌再血管化为目的,成为外科方式治疗严重冠心病的最终有效手段。目前心肌再血管化常用的桥血管是自体静脉,但即使应用多种药物治疗,术后两年仍约有20%-40%的移植静脉狭窄甚至闭塞,CABG的疗效随之也受到严重影响。因此,如何防止或减缓移植静脉的再狭窄已经成为心脏外科冠脉治疗首要解决的问题。血管内皮损伤通常被认为是移植静脉内膜增生的始动环节,内皮细胞(endothelial cells,ECs)作为重要的血管屏障,能够防止单核细胞粘附及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增生。血管内皮细胞的凋亡破坏了这一血管屏障,并将VSMCs直接暴露在血流的冲击中,随后导致了炎症细胞的粘附和激活。处于激活状态的炎症细胞会释放过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),一般包括H202和超氧化物阴离子O2-等。ROS是激发氧化应激瀑布反应的关键因素,这些ROS不仅导致细胞凋亡,而且诱发大量炎症因子的产生,这些炎症因子将会进一步趋化、招募更多的炎症细胞,比如单核-巨噬细胞等向损伤部位快速聚集。这一恶性循环造成大量ROS的产生,从而对血管内皮细胞造成持续、剧烈的氧化应激损伤,延缓损伤血管的再内皮化,最终导致血管内膜增生。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能够从骨髓组织被动员进入外周血并特异性迁移、归巢到血管损伤部位,分化成为内皮细胞,并发挥内皮细胞功能,以促进内皮修复。MSCs能够有效归巢是其发挥促进组织修复功能的重要前提,大家广泛认为基质细胞衍生因子-1α/C-X-C亚族趋化因子受体4(SDF-lα/CXCR4)在调节干细胞迁移的过程中具有重要作用。因此,上调MSCs的CXCR4表达可以促进其归巢至损伤血管内皮。但是,有研究发现静脉移植后,移植血管内膜和循环血液中均可检测到氧化应激反应,在术后较短时间内即发生,并且可以持续数周,另外在大鼠颈动脉球囊损伤模型中也发现氧化应激参与了内膜增生。在形成的氧化应激环境中,各种反应氧产物,包括H202和超氧化物阴离子O2-等大量产生,这些大量和/或持续的氧化应激产物刺激可以降低MSCs的功能及活性,并增加其凋亡,严重影响MSCs移植的治疗效果。核因子-κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)通路广泛参与了对多种趋化蛋白、细胞因子和粘附分子等翻译产物的基因表达及调控过程。IκB kinase(IKK)复合物包括两个催化亚基IKK-α和IKK-β,及一个调节亚基(IKK-γ/NEMO)。IKK-α和IKK-β对于NF-κB通路发挥调节功能具有关键作用。B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)基因可以编码抗凋亡蛋白Bcl-2,并且Bcl-2的启动子上包含NF-κB的特异性结合序列从而受其调控,所以理论上NF-κB能够借助上调Bcl-2及其它凋亡抑制基因的表达而减轻细胞凋亡。其它研究也发现,NF-κB通路与定向迁移功能的调节有关。因此我们试图利用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),一种重要的促炎症因子刺激来实现NF-κB通路的活化,促进MSCs在氧化应激环境中的存活及迁移功能,以更有效的实现移植静脉内膜增生的预防及治疗。本研究旨在通过TNF-α预处理(precondition,PC)MSCs,观察MSCs表达的总CXCR4及细胞表面CXCR4的水平、细胞迁移活性、增殖及分泌功能的变化。借助这些实验我们可以明确TNF-α对于MSCs活性的调节作用,并且观察在这些生物学功能变化过程中NF-κB通路发挥的作用。然后我们通过筛选出以IKK-α为靶基因的表达水平有明显改变的miRNA,进一步探讨miRNA在在TNF-α调控NF-κB通路过程中所发挥的作用。利用动物实验则可以验证TNF-α通过NF-κB通路促进MSCs在氧化应激环境下的存活及迁移功能的作用,并观察TNF-α预处理的MSCs治疗移植静脉内膜增生的效果。总的来说,本实验着重于探讨TNF-α对于MSCs在氧化应激环境下的存活及迁移功能的影响及其机制,并证实TNF-α预处理能否改善MSCs对于移植静脉内膜增生的预防及治疗作用。本研究内容共包括以下三个部分。第一部分肿瘤坏死因子-α通过NF-κB通路促进MSCs在氧化应激环境中的存活及迁移功能目的:研究肿瘤坏死因子-c(TNF-α)对于间充质干细胞(MSCs)的迁移、增殖、分泌功能等生物学功能的影响,并进一步明确TNF-α对于MSCs在氧化应激环境中存活及迁移等功能的影响,同时阐述NF-κB通路在这些调节过程中发挥的作用。方法:1.用不同浓度的TNF-α(0、10、30、50ng/ml)刺激MSCs,24小时后应用Western blot检测总蛋白中NF-κB-p65和p-NF-κB-p65表达水平的变化,并选定最佳作用浓度。2.NF-κB通路拮抗剂IKK Ⅻ提前30分钟预处理MSCs,再选用TNF-α 进行刺激,Western blot 检测 p-IKK-α/IKK-α 和 p-IKK-β/IKK-β 的表达变化,明确TNF-α对于NF-κB通路的活化作用。实验分组:Ⅰ.对照组,使用α-MEM+10%胎牛血清(FBS)的完全培养基,不添加IKK Ⅻ及TNF-α;Ⅱ.TNF-αα组:完全培养基中添加TNF-α(终浓度为50ng/ml),培养24小时;Ⅲ.IKK Ⅻ+ TNF-α组:培养基中先添加IKK Ⅻ(终浓度为5μM),培养30分钟,以阻断NF-κB通路,然后加入TNF-α(终浓度为50ng/ml),培养24小时;Ⅳ.IKK Ⅻ组:培养基中添加IKK Ⅻ(终浓度为5μM),培养24小时。3.流式细胞周期检测分析TNF-α对于MSCs细胞周期的影响;CCK-8检测分析TNF-α对于MSCs细胞总活性的影响;EdU检测分析MSCs增殖功能的改变。4.IKK Ⅻ+TNF-α组额外加入SB203580(P38-MAPK通路拮抗剂),Western blot检测p-p38和p38的表达变化,明确TNF-α对于P38-MAPK通路的作用;CCK-8检测NF-κB通路和P38-MAPK通路对于细胞活性的影响。5.Westernblot检测p-NF-κB-p65/NF-κB-p65和CXCR4的表达变化,并应用流式细胞表型分析检测MSCs表面CXCR4的表达,明确NF-κB通路对于CXCR4表达的调控作用;Transwell实验证实TNF-α对于MSCs迁移功能的影响。6.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组MSCs在氧化应激环境中的凋亡情况,并应用Western blot检测各组MSCs在氧化应激环境中Bcl-2和CXCR4的表达变化,以研究氧化应激环境对于MSCs产生的影响,及TNF-α预处理对其存活及迁移功能的作用。结果:1.随着TNF-α刺激浓度不断提高,p-NF-κB-p65表达量逐步增加,表现为剂量依赖性,50ng/ml浓度的TNF-α显著激活了NF-κB通路。2.TNF-α刺激后,NF-κB通路的上游调节蛋白IKK-α/β的磷酸化明显上调,IKK Ⅻ能够阻断此作用。3.流式细胞周期检测发现,TNF-α上调NF-κB通路后,位于S期的细胞比率明显上升,提示细胞增殖能力可能获得了提升;CCK-8检测结果显示TNF-α组细胞的总活性显著提高,而且IKK Ⅻ能够阻断此作用,但是IKK Ⅻ+TNF-α组细胞总活性低于IKK Ⅻ组;EdU检测证实了 TNF-α对于MSCs的增殖促进作用,并且IKK Ⅻ能够拮抗此效应。4.TNF-α同时激活了P38-MAPK通路,SB203580可以阻断该通路的激活。CCK-8实验显示IKK Ⅻ+TNF-α组P38-MAPK通路的激活导致了细胞活性的下降,应用SB203580额外阻断P38-MAPK通路后总细胞活性显著升高。5.TNF-α显著提高了p-NF-κB-p65和CXCR4的表达,p-NF-κB-p65和CXCR4的表达有相同的变化趋势;Transwell实验证实TNF-α明显促进了MSCs的迁移功能,IKK Ⅻ能够拮抗此效应。6.Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡术检测发现MSCs在氧化应激环境中出现大量凋亡,而TNF-α预处理能够显著减轻凋亡。氧化应激导致Bcl-2和CXCR4的表达下降,TNF-α可以明显上调其表达,并且IKK Ⅻ能够拮抗此效应。结论:TNF-α通过IKK-α/β的磷酸化激活NF-κB通路。TNF-α显著增强了MSCs的增殖和迁移功能,在这些过程中NF-κB通路起着关键的调控作用。TNF-α通过NF-κB通路明显减轻了 H2O2诱导的细胞凋亡水平,并且有效改善了氧化应激环境中MSCs的迁移功能。第二部分miR-23b-3p参与肿瘤坏死因子-α对NF-κB通路活化的调控过程目的:研究微小RNA(microRNA,miRNA)在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对间充质干细胞NF-κB通路调控过程中所起的作用。筛选出与催化亚基IKK-α相关程度高的miRNA,并进行内源及外源性验证。同时研究miRNA表达与NF-κB通路及下游功能活性的关系。方法:1.根据 TargetScan7.1、miRbase、microRNA.org等对 miRNA 靶基因及其结合位点的预测,找出可能以IKK-α为靶基因的miRNA,并以这些miRNA作为目标进行后续研究。通过qRT-PCR检测TNF-α作用于MSCs后这些miRNA的变化,并筛选出最相关的miRNA。2.合成目标miRNA的模拟物(mimic)及抑制物(inhibitor),并合成IKK-α的野生型及突变型双荧光素酶报告基因质粒。利用双荧光素酶实验外源性验证IKK-α是否为目标miRNA的靶基因。3.Western检测目标miRNA与NF-κB通路活性及CXCR4表达水平的关系。4.Transwell试验检测瞬时转染目标miRNA的inhibitor对MSCs迁移能力的影响。结果:1.根据网站预测及qRT-PCR分析,我们发现以IKK-α为靶基因的miRNA中,miR-23b-3p在TNF-α刺激后下降最为明显,故将以miR-23b-3p作为目标进行研究。2.miR-23b-3p可以明显抑制转染野生型报告质粒的细胞中萤火虫荧光素酶表达,而不能明显抑制转染突变型报告质粒细胞中萤火虫荧光素酶表达。双荧光素酶报告基因系统外源验证了 IKK-α为miR-23b-3p的靶基因。3.miR-23b-3p mimic能够下调NF-κB通路活性,并降低CXCR4的表达水平。miR-23b-3p inhibitor可以活化NF-κB通路活性,并促进CXCR4的表达。4.Tanswell试验证实瞬时转染miR-23b-3p inhibitor能够促进MSCs的迁移。结论:TNF-α可以下调miR-23b-3p的表达,减弱miR-23b-3p对于IKK-α的抑制作用,从而活化NF-κB通路,并促进了MSCs的迁移功能。miR-23b-3p参与了TNF-α对NF-κB通路的调控过程。第三部分肿瘤坏死因子-α预处理的MSCs治疗移植静脉内膜增生的效果研究目的:研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)预处理对间充质干细胞(MSCs)体内存活及迁移能力的影响,探讨TNF-α预处理MSCs治疗移植静脉内膜增生的效果。方法:1.TNF-α预处理MSCs24小时(TNF-α-PCMSCs),CM-Dil标记细胞。随后收集CM-Dil标记的TNF-α-PCMSCs,并通过尾静脉注入静脉移植大鼠模型体内。2.术后1天、1周,分别收集大鼠血液标本,并分离血清,ELISA检测标本中的丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)浓度,以评价模型体内氧化应激水平。3.药物预处理MSCs 24小时后,收集各组细胞培养液,离心后用于ELISA检测细胞分泌VEGF和HGF水平。4.1周后取材移植静脉,制成冰冻切片,并立即在荧光显微镜下观察以示踪细胞归巢情况。5.Tunel法检测移植静脉标本的内皮细胞凋亡程度。6.4周后取材移植静脉,制备成石蜡标本,使用Van Gieson染色以检测移植静脉的内膜增生程度。结果:1.活细胞示踪剂CM-Dil能够成功标记MSCs,且不影响细胞活性。2.静脉移植术后1天,收集血清中MDA的浓度明显增加,静脉移植术后的大鼠血液循环中存在氧化应激。3.静脉移植1周以后,TNF-α-PCMSCs治疗组较Non-PCMSCs组中MDA的血清含量下降更加显著。4.TUNEL实验发现静脉移植后即出现内皮细胞凋亡,TNF-α-PCMSCs治疗能够显著减轻静脉移植后血管内皮细胞凋亡。5.TNF-α-+PCMSCs在正常环境或氧化应激环境下,VEGF和HGF的分泌水平均较Non-PCMSCs明显升高。6.通过荧光显微镜观察CM-Dil标记的MSCs的归巢能力,对比Non-PCMSCs,更多数量的TNF-α-PCMSCs归巢到了移植静脉内膜,IKK Ⅻ预处理则可以阻断这一效应。7.VanGieson染色发现,TNF-α-PCMSCs组移植静脉的新生内膜厚度较Non-PCMSCs组变薄,血管内膜增生程度显著减轻。结论:静脉移植术后的血液循环中存在氧化应激状态,TNF-α可以改善氧化应激环境中MSCs的存活和迁移功能,从而使更多数量的TNF-α-PCMSCs能够归巢到移植静脉内膜,以促进血管再内皮化。IKK Ⅻ预处理能够阻断这些效应,则可以证实在这些过程中NF-κB通路起着关键的调控作用。另外TNF-α-pCMSCs可以通过旁分泌VEGF和HGF等促生存因子减轻氧化应激导致的内皮细胞凋亡,并且内皮细胞凋亡的减轻反过来可以降低氧化应激水平,二者共同作用从而使移植静脉内膜增生得到有效缓解。利用经TNF-α预处理的MSCs治疗,可以更有效的防治移植静脉的内膜增生。创新及意义本课题证实了TNF-α可以通过促进IKK-α/β的磷酸化激活NF-κB通路,并且显著增强了MSCs的迁移功能和抗凋亡活性,在这些过程中NF-κB通路起着关键的调控作用。并且发现miR-23b-3p参与了TNF-α对NF-κB通路的调控过程,miRNA对于通路调控的复杂机制还需进一步研究。TNF-α通过活化NF-κB通路可以改善氧化应激环境中MSCs的迁移功能,并增加术后动物模型体内MSCs的存活数量。利用经TNF-α预处理的MSCs治疗,可以更有效的防治移植静脉的内膜增生,改善MSCs预防桥血管狭窄的作用。本课题为提高间充质干细胞的移植治疗效果提供了理论基础与新思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R654.2
【图文】：

标志物,造血细胞,旋涡状,流式细胞术

１．邋（Ａ）体外培养至第３代的ＭＳＣｓ呈现均一的成纤维细胞样形态，细胞呈逡逑梭形，旋涡状排列生长；（Ｂ）流式细胞术鉴定结果显示：造血细胞标志物逡逑Ｄ３４和ＣＤ４５阴性；干细胞抗原标志物ＣＤ２９、ＣＤ４４和ＣＤ９０阳性。结果证逡逑试验中所用的细胞群为ＭＳＣｓ。逡逑

比率,细胞,磷酸化作用,活化作用

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磷酸化,磷酸化作用,活化作用,拮抗剂

图２．邋（Ａ）邋ＴＮＦ－ａ主要促进ＮＦ－ＫＢ－ｐ６５的磷酸化，而ＮＦ－ｋＢ－Ｐ６５本身的表达逡逑水平没有明显变化。ＩＮＦ－ｏｔ能够活化ＮＦ－ｋＢ通路，而且该活化作用呈剂量逡逑依赖性，５０ｎｇ／ｍｌ的药物浓度即可达到有效活化（＊Ｐ＜０．０５）邋；邋（Ｂ）ＴＮＦ－ａ可逡逑以通过促进ＩＫＫ－ａ／卩磷酸化激活ＮＦ－ｋＢ通路，该磷酸化作用可以被ＩＫＫ－ａ／ｐ逡逑拮抗剂ＩＫＫＸＥ所拮抗（＊Ｐ＜０．０５）。逡逑§１逡逑ｉ逦W邋Ｄｉｐ邋Ｇ１邋６８邋６２％逦ｇ」逦色逦W邋Ｄｉｐ邋Ｇ１邋６５邋５９邋％逡逑｜逦■邋Ｄｉｐ邋Ｇ２邋６．７１邋％逦Ｑ逦■邋Ｄｉｐ邋Ｇ２邋４邋３７邋％逡逑ｉ－ｒ逦Ｉ逦□邋ＤｉｐＳ邋２４邋６７％逦Ｓ－逦屋逦□邋Ｄｉｐ邋Ｓ邋３０邋０４。／0逡逑Ｉ逦ｌ５逦Ｉ逦ｆ逡逑Ｉ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逦墨逦ＴＮＦ－ｔｔ逦ｗ邋４0－．逦＾ｔ逡逑．ｔ３０＇邋ｆｉ逡逑４逦Ｍ逦Ｍ邋？Ｊ0ｘ逦’＊逦Ｍ逦２５０逦＾邋２0－Ｓ逦１逦＾逦ｌｉｉ邋？逡逑ｓ：邋｜邋Ｓ邋蹀ｊ逦ｓ⑶■W邋｜邋W 逡逑！

【参考文献】