负压伤口疗法对小鼠烧伤感染创面的作用及基于转录组测序的机制探索

发布时间：2020-07-26 23:53

【摘要】：目的研究负压伤口疗法(negative pressure wound therapy,NPWT)对小鼠烧伤感染创面愈合的作用,并基于全转录测序探讨其潜在相关作用的分子机制。实验方法1)构建小鼠背部烫伤感染创面模型,并随机分为治疗组和对照组,24h后行切痂术,NPWT组创面使用聚氨酯泡沫敷料覆盖创面并生物半透膜封闭、连接负压吸引,对照组聚氨酯泡沫敷料覆盖创面并生物半透膜封闭,不连接负压。观察指标如下:(1)观察记录小鼠创面感染和愈合状况;(2)采用多普勒血流仪检测第1、3、5、7天创面血流情况;(3)取第1、3、5、7天小鼠创缘组织切片,HE染色观察小鼠创缘组织病理变化,免疫组化观察CD31、Ki67、VEGF和TGF-β1表达变化;(4)ELISA检测创缘组织中IL-1β、TNF-α、VEGF和TGF-β1含量。2)构建在体动物模型及随机分组方法同前,实验组给予NPWT治疗,对照组治疗同上,于治疗24小时之后收集创缘皮肤组织提取总RNA,检测合格后,进行转录组测序及生物信息学分析,基本步骤如下:(1)使用Illumina HiseqXten对样品上机测序,对测序数据全基因组定位、基因结构分析、染色体定位分析以保证结果可信度,计算基因表达量,并筛选NPWT组与对照组的差异表达基因。(2)根据circRNA结构特征,对样本中可能存在的circRNA进行预测,计算表达量并筛选差异表达。(3)根据mRNA差异基因筛选结果,用DESeq算法进行差异基因筛选(DifGeneFinder),得到差异表达的lncRNA。(4)从总RNA中分离纯化18-30nt的miRNA分别在各miRNA的3’和5’端接头序列上用T4连接酶连接,然后通过RT-PCR进行扩增,所得miRNA文库进行测序分析并筛选差异表达基因。(5)采用生物信息学的工具和方法对NPWT治疗后小鼠感染创面组织中差异表达基因进行本体功能分类、基因调控网络的构建、信号通路分析及网络构建、互作关系分析、circRNAs/lncRNAs-miRNAs-mRNAs的靶标关系预测分析,筛选出可能在NPWT促进创面愈合中发挥关键作用的circRNAs,lncRNAs,miRNAs和mRNAs并对分析筛选结果进行初步验证。实验结果1)在实验第1、3、5天,NPWT组中标记菌荧光表达量均显著低于对照组(P0.01);小鼠创面,第3天与对照组相比NPWT组面积即显著缩小(P0.05),该差异性至实验观察最后时间点第7天;创面血流,在实验第3、5、7天,与对照组相比NPWT组灌注量显著升高(P0.01)。创面组织HE染色结果显示,NPWT组中炎性细胞浸润数量与对照组相比显著降低(P0.05)。免疫组化结果显示与对照组相比,NPWT组CD31,Ki67,TGF-β1,VEGF表达量均显著增加(P0.05)。ELISA结果显示,NPWT组创缘组织中TNF-α水平在伤后1、3、5天均显著低于对照组(P0.01);NPWT组中IL-1β的水平在实验过程中没有显著变化,对照组中IL-1β表达在实验开始前3天显著升高(P0.01);NPWT组创缘组织中VEGF的表达量在实验第3天显著升高(P0.01),并持续到实验结束,对照组在实验第3天后表达水平逐渐升高,但仍显著低于NPWT组;TGF-β1表达水平在实验开始后第1天,NPWT组即显著高于对照组(P0.01)并在实验第3天达到峰值。上述结果表明,NPWT能促进创面愈合,并能引起广泛的生物学效应。2)通过RNA-seq技术成功构建了各样本的转录组,具体分析结果如下:(1)得到864个显著差异mRNAs,其中上调610个,下调254个;预测到共有37个显著差异circRNAs,12个上调和25个下调;108个显著表达差异lncRNAs,68个上调,39个下调;67个具有显著差异miRNAs,其中37个上调,30个下调。(2)通过生物信息学分析筛选出与miRNAs存在关系的差异显著的外显子型circRNAs有5个,与其存在ceRNA关系的miRNAs有4个,包括mmu-miR-877-3p,mmu-miR-669m-5p,mmu-miR-1224-3p,mmu-miR-497a-5p,它们调控52个显著差异的mRNA。分析显示这些基因功能集中在免疫反应、炎症应答、病毒防御等免疫功能相关的基因表型。筛选出差异显著的长度大于200bp lncRNAs有107个,GO本体分析结果显示其与circRNAs的结果完全一致;而与这些lncRNAs存在ceRNA关系的miRNAs中有3个与cricRNAs也存在ceRNA关系,即mmu-miR-669m-5p,mmu-miR-1224-3p,mmu-miR-497a-5p。故存在功能交集并受到circRNAs和lncRNAs共同调控的显著差异基因有44个mRNAs,综上所述,经生物信息分析,课题组筛选出3个circRNAs、5个lncRNAs、3个miRNAs、44个mRNAs可能是NPWT促进创面愈合中发挥关键作用的分子,功能集中在免疫反应、炎症应答、病毒防御等免疫功能相关的基因表型。通过对上述显著差异的cricRNAs、lncRNAs、miRNAs和mRNAs等分子的表达情况进行qPCR实验验证,并对mRNAs编码的蛋白进行western blotting实验验证。qPCR验证结果与测序检测结果一致,western blotting验证,确定TIFA、GLA、PLCB2、CD84及SLFN9等分子在实验组中出现显著上调,这与测序检测结果基本一致。结论1.烧伤感染创面可引起小鼠创面局部组织中细菌增殖,炎性反应增高,血流灌注降低,阻碍创面愈合,NPWT治疗可减轻创面局部感染,增加血流灌注,抑制抗炎因子表达,促进生长因子表达,加速创面愈合进程。2.应用转录组测序技术,在构建小鼠转录组表达谱基础上,通过生物信息分析发现,NPWT可能是通过mmu_circ_0004796,mmu_circ_0011322,mmu_circRNA_Hnrnpll,LOC102634528,LOC102639837,LOC102639918,4930431P03Rik,Gm10782调控mmu-miR-669m-5p,miR-1224-3p和miR-497a-5p继而影响TIFA,GLA,CD300a,PLCB2,EIF2AK2,CD84,SLFN9,Lasp1,GDF11等的表达发挥促进创面愈合作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R644
【图文】：

细胞内,皮肤干细胞

1 细胞内遗传信息的传递（B r C. Circulation, 2016, 134(19): 1484-1499.）NA 是一种高度保守的、内生性的 ncRNA 分子，在各类真核生物中类短链、非编码的 RNA，无开放阅读框（ORF）。它们的长度一般只单位，3’端可有 1-2nt 的长度变化[52]。成熟的 miRNA 有５’端磷酸这使其有别于其他寡核苷酸及功能 RNA 降解片段[53,54]。最近的一些A 在许多病理生理过程中发挥重要作用，其中包括细胞信号通路的们主要通过与目标 mRNA 结合，调节 mRNA 的降解或抑制转录过程基因的表达[55]。这些 ncRNA 都是临床相关疾患潜在的基因治疗靶点物，对于将来相关疾病的诊治具有重要意义。的一些研究证实，miRNA 在皮肤的多种细胞的基因表达调节过程中其中包括皮肤干细胞、免疫细胞和角质细胞[56]。有研究发现，在小充质干细胞中，miR-27b 是皮肤干细胞的一种特异性指标。miR-27

荧光,创面愈合,创面,对照组

表 1 NPWT VS Control 组小鼠创面愈合率 ( % , x ±S )分组动物数创面愈合率（%）Day1 Day3 Day5 Day7NPWT 15 1.5 ±0.4 15.9 ±6.3* 24.5 ±5.9* 38.8 ±5.5*Control 15 1.4 ±0.5 8.7 ±2.8 16.7 ±3.6 24.3 ±3.8注：NPWT VS Control 创面愈合率比较，*P ＜ 0.054.2 创面标记细菌荧光强度检测实验开始第 1 d，两组间创面标记菌表达没有显著差异 ( P ＞0.05 )。实验开始后第 3d ，NPWT 组中荧光表达显著降低，而对照组中荧光表达显著升高（P ＜0.01），并在实验第 3 d 达到峰值。在实验的第 3、5 d，NPWT 组的荧光表达量均显著低于对照组（P ＜ 0.01）。见图 2。

背部,小鼠,对照组,实验观察

2 NPWT VS Control 小鼠背部血流灌注对比 *P ＜ 0.014.4 ELISA 测定创缘组织中 TNF-α 和 IL-1β 的含量变化如图 4 所示，创缘组织中 TNF-α 和 IL-1β 在实验开始时没有明显差异（P＞0.05）。对照组中 TNF-α 在实验第 2 d 即快速升高，在实验第 3 d 达到峰值；NPW组中 TNF-α 在第 2 d 显著升高，但显著低于对照组（P ＜ 0.01）且在实验第 2 天即开始回落，在整个实验观察期的前 5 d ，NPWT 组中 TNF-α 含量均显著低于对照组（P ＜ 0.01）。NPWT 组中 IL-1β 的水平在实验过程中没有显著变化，对照组中 IL-1表达在实验第 3 d 显著升高（P ＜ 0.01）。

【参考文献】