HO-1对小鼠肝窦内皮细胞缺氧—复氧损伤保护作用的实验研究

发布时间：2020-07-27 22:37

【摘要】：[背景]缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injurry,IRI)是出现在肝脏移植手术中常见的病理生理过程,细胞在缺血缺氧过程中发生溶解、凋亡,严重影响了移植肝功能。早期再灌注损伤机制包括Kupffer细胞活化、肝细胞膨胀及肝脏微循环功能障碍,而肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)在调节肝脏微循环中占据了主要地位。研究表明,在肝脏IRI时LSEC是最先发生功能异常的细胞,早期LSEC结构和功能的损伤是构成肝脏IRI病理发生发展的基础。因此,有效的保护LSEC活性和功能是减轻IRI的关键。近年来,具有细胞保护作用的血红素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)成为了研究热点。HO-1亦称热休克蛋白32,作为细胞氧化应激最敏感的指标,在炎症、缺氧、放射等损伤过程中,通过上调表达量调节细胞促炎因子释放和抑制细胞凋亡,从而发挥细胞保护作用。以往研究表明,诱导HO-1高表达能够显著减轻肝脏缺血再灌注损伤,其机制之一可能是通过抑制Kupffer细胞分泌炎症介质及抗细胞凋亡等作用保护肝脏。但现阶段关于LSEC在肝脏缺血再灌注损伤中表达HO-1的情况尚不清楚,特别是HO-1对LSEC保护作用的研究尚未见报道。[目的]本研究采用HO-1过表达腺病毒载体行小鼠LSEC体外转染,通过“低血清、缺氧-复氧”培养方法建立体外小鼠LSEC缺血再灌注损伤模型,探讨LSEC缺氧-复氧损伤后,HO-1对LSEC的保护作用。[方法]1、实验分组:将LSEC随机分为以下6组,空载体腺病毒转染组(enhanced green fluorescent protein group,EGFP 组);HO-1 腺病毒转染组(heme oxygenase 1 group,HO-1组);空白对照组(control group,细胞不进行任何腺病毒转染),将以上三组接受不同干预的细胞分别进行缺氧-复氧(H-R)培养和常氧(Normoxia)培养,即 H-R 干预下的 control、EGFP 和 HO-1 组;Normoxia 干预下的 control、EGFP 和 HO-1 组。2、腺病毒转染效率检测:选取生长汇合度达80%～90%的LSEC分别进行空载体腺病毒转染和HO-1高表达腺病毒转染。在转染48小时后,用倒置荧光显微镜观察细胞转染后的荧光显色及转染效率;用RT-qPCR和Western blot检测细胞转染后HO-1的mRNA和蛋白表达水平。3、模型建立:当细胞生长汇合大于80%时,更换低血清(5%)细胞培养基,将细胞放于37℃,N2体积分数为95%、C02体积分数为5%的混合气体培养箱中进行缺氧培养6小时,随后放回37℃,空气体积为95%、CO2体积分数为5%的混合气体培养箱中进行复氧培养24小时,完成LSEC体外缺血再灌注损伤模型的建立。空白对照组置于常氧细胞培养箱(37℃,空气体积分数95%、C02体积分数5%)中培养。4、ELISA检测细胞因子释放:实验模型建立完成后,收集细胞培养液,.离心后选取培养上清液,根据小鼠ELISA试剂盒分别进行IL-6、TNF-α表达水平检测。5、流式细胞学检测细胞凋亡:实验模型建立完成后,弃去细胞培养液,加入Annexin V/Alexa Fluor647检测试剂,通过流式细胞分析仪进行LSEC凋亡率检测。.6、CCK-8检测细胞活性:根据CCK-8细胞活性检测试剂盒操作说明,对完成缺氧-复氧损伤后的LSEC活性进行检测。7、RT-qPCR法检测:检测小鼠LSEC中HO-1mRNA水平的表达量。8、Western blot法检测:检测小鼠LSEC中HO-1蛋白水平的表达量。9、统计学分析:所有数据采用Windows XP操作系统,SPSS 13.0统计分析软件对数据进行统计分析,组间差异采用双因素方差分析,均数之间用独立样本的t检验。结果用均数±标准误(x±SEM)表示,以P0.05表示差异有统计学意义。[结果]1、腺病毒转染效率:HO-1高表达腺病毒在最佳剂量(MOI=80)转染LSEC时,转染效率大于80%,且细胞形态保持稳定,并能在LSEC中显著表达HO-1 mRNA和蛋白,差异具有统计学意义(P0.05)。2、ELISA 检测结果:H-R 干预组(control、EGFP 和 HO-1 组)LSEC 的 IL-6和TNF-α水平都高于Normoxia干预组(control、EGFP和HO-1组),(每组n =6,*P0.05 和**P0.01)。与 EGFP 组相比,HO-1 组上清液的 IL-6 和 TNF-α水平显著降低(###P0.001)。3、流式细胞检测细胞凋亡结果:HO-1组相比于EGFP组(H-R干预后)凋亡细胞数量减少(每组n = 3,**P0.01)。4、CCK-8检测细胞活性结果:EGFP和HO-1组的细胞活力低于对照组(每组n = 5,**P0.01和***P0.001)。在受到H-R干预后的细胞中,HO-1组与EGFP组相比,观察到HO-1组的细胞活力显著增加(**P0.01)。5、RT-qPCR检测结果:与对照组和EGFP组相比,用Ad-HO-1转染LSEC的HO-1mRNA表达水平显着上调。在HR干预组(control、EGFP和HO-1组)中HO-1mRNA的表达水平显著下调(每组n = 6组,WP0.001)。H-R干预后,所有H-R干预组HO-1 mRNA水平显著低于Normoxia干预组。6、Western blot检测结果:在转染Ad-HO-1基因后HO-1组LSEC的HO-1表达上调,而H-R干预组与Normoxia干预组(control、EGFP组和HO-1组)比较,HO-1 表达明显下调(每组n = 3,*P0.05,**P0.01,***P0.001)。[结论]1、腺病毒载体体外转染小鼠LSEC高表达HO-1的方法具有可行性和稳定性;“低血清、缺氧-复氧”培养法小鼠LSEC体外缺血再灌注损伤模型符合临床肝脏缺血再灌注损伤病理生理过程,是一种稳定性和可操作性强的实验模型。2、缺氧-复氧损伤模型所致的细胞应激反应可降低LSEC中HO-1的表达,具体机制尚不清楚,可能与LSEC超微结构破坏导致肝脏微循环衰竭有关。3、HO-1可通过抑制细胞促炎因子释放、减少细胞凋亡,从而减轻LSEC缺氧-复氧损伤,起到保护LSEC的作用。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R657.3
【图文】：

小鼠,贴壁培养,所指,箭头

图１．离心后产生的小鼠逦

贴壁培养,小鼠

：逡逑Ｔｒｉｓ逦０．６０５邋ｌｇ逡逑甘氨酸逦２．８８２６ｇ逡逑甲醇逦４０ｍｌ逡逑加水至逦２００ｍｌ逡逑６）ＴＢＳＴ邋缓冲液：２０％Ｔｗｅｅｎ２０，邋１．１８ｍｌ，加入邋ＴＢＳ邋缓冲液至邋５００ｍｌ。逡逑２．２小鼠肝窦内皮细胞（ＬＳＥＣ）培养逡逑原代Ｃ５７ＢＬ／６小鼠ＬＳＥＣ购自ｉＣｅｌｌ公司。购买来的原代小鼠ＬＳＥＣ生长于逡逑２５ｃｍ２培养瓶中，将细胞消化离心后底层的ＬＳＥＣ接种到６孔细胞培养板中贴壁逡逑培养（图１、２、３），向每孔内加入原代内皮细胞培养基，培养在３７°Ｃ，９５％空逡逑气、５％Ｃ０２的培养箱中，并且每２４小时更换培养基。在原代培养２至３天后对逡逑细胞进行腺病毒转染及缺氧－复氧（Ｈ－Ｒ）模型建立。逡逑

贴壁培养,小鼠

【参考文献】