纳米复合纤维膜诱导间充质干细胞成软骨分化研究

发布时间：2020-08-10 05:56

【摘要】：目的:探究以木质素(Lignin)和聚乳酸(PLA)用静电纺丝技术制备纳米复合纤维膜的可行性,研究其体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化能力,筛选对细胞生长和诱导最佳组植入SD大鼠(Sprague-Dawley)的膝关节软骨缺损模型验证纳米复合纤维膜修复大面积浅表层软骨缺损的效果。方法:第一部分,纳米纤维膜的合成。先将木质素和PLA合成LP共聚物,再以不同比例与PLA混合,用静电纺丝技术制成纳米复合纤维膜。对其进行材料的表征:扫描电镜拍照,观察纤维形态并计算纤维直径;测量拉伸强度和杨氏模量,验证纤维膜的力学强度;蠕变恢复测试是分析聚合物膜弹性。第二部分,纳米复合纤维膜体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化研究。根据不同比例的纳米复合纤维膜作为实验组并建立爬片组作为空白对照,提取SD大鼠的骨髓间充质干细胞经体外扩增培养后,接种到各个纤维膜组以及爬片组中,培养7天后,用扫描电子显微镜(SEM)观察细胞和支架的粘附形态;培养21天后,钙黄绿素素/碘化丙啶染色和DNA增殖检测纤维膜的支持生长能力,糖胺聚糖(GAG)的分泌量检测,鬼笔环肽/33258荧光染色,Ⅱ型胶原免疫荧光染色等检测成软骨分化特征;分别选7、14和21天样品检测软骨相关特征基因的表达(荧光定量PCR)验证成软骨分化能力。第三部分,纳米复合纤维膜体内修复大鼠关节浅表层软骨缺损实验。打开SD大鼠关节腔,用手持小电钻磨掉一个的软骨缺口,制备大鼠膝关节浅表层软骨缺损模型,植入筛选出的最优组细胞-纳米复合纤维膜,同时设立对照组;在术后2、4和6周进行取材和收样,进行大体观察评分和组织学评分,多聚甲醛固定后石蜡包埋切片染色,观察修复情况。结果:成功合成了LP共聚物并通过静电纺丝技术制备了一系列的PLLA/Lignin纳米复合纤维膜,通过材料表征实验测量纤维直径范围从最大的712±63nm到最小的350±80nm;拉伸强度最大3.49±0.20MPa,最低,为2.49±0.14MPa;杨氏模量最为56.8±1.6MPa,最大为66.8±2.8MPa等。体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨的实验中,细胞DNA增殖检测和Calcein-AM/PI荧光染色检测的是细胞的增殖和活性,PLLA-Ligp30%组细胞增殖和活性最好;扫描电镜观察细胞在材料中粘附和生长情况,细胞与各组纤维膜都能较好的粘附生长,其中PLLA-Ligp30%铺展和形态改变最为明显,有一定的分化趋势;GAG分泌量检测,二型胶原免疫荧光染色和PCR结果显示,各纤维膜组材料相比空白爬片组均有一些促进间充质干细胞成软骨分化的趋势,COLⅡ、SOX9、和ACAN等软骨特征性基因的表达量明显较高,综合而言其中PLLA-Ligp30%组的诱导效果最好;通过纤维状肌动蛋白分泌检测观察细胞核周围肌动蛋白骨架的交织情况,PLLA-Ligp30%纳米复合纤维膜组的肌动蛋白骨架与材料纤维充分交织,与上述检测具有一致性。通过大鼠体内实验观察,植入了细胞-纳米复合纤维膜组的大鼠关节,其软骨缺损修复效果明显好于对照组,且具有抑制关节炎症产生的现象;组织学染色检测也证明了大体观察的结果,用间充质干细胞-纳米复合纤维膜结合可以在体内进行成软骨分化的诱导,促进关节浅表层软骨缺损修复。结论:将木质素-PLA共聚物用静电纺丝技术成功制备了不同比例成分的纳米复合纤维膜。通过体外实验证明其具有明显的成软骨分化能力并在植入体内后能够修复浅表层的关节软骨缺损。通过本次研究,可以为创新复合生物材料提供方向,为软骨诱导性材料的设计提供理论依据。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08;R68
【图文】：

依据扫描电镜观察结果图 1-2 所示，所有纤维均表现出均匀且无珠粒的纳米尺寸形态，各组的纤维直径范围从最大的纯 PLLA 的 712±63nm 到最小的 PLLA/Ligp50%的 350±80nm，图 1-3A 显示随着木质素比例的增加，纤维直径逐步减小；图 1-1 LP 共聚物的合成路线Fig.1-1 Synthesis steps of lignin-PLA (LP) copolymers

纳米复合纤维膜诱导间充质干细胞成软骨分化研究 2015 级硕士学位论文纳米纤维膜的杨氏模量测试结果如图 1-3C 所示，PLLA 组的杨氏模量为56.8±1.6 MPa 而 PLLA/Ligp50%组的杨氏模量最大，为 66.8±2.8MPa。添加了 LP 共聚物的组中仅 PLLA/Ligp10%和 PLLA/Ligp30%组模量略小于PLLA 组，其他各组均有所升高。

4 讨论在开发和合成新的软骨诱导材料时，细胞所处的微环境及材料的表征结构都需要有清楚的掌握[30]。在这项研究中，结合了天然材料和人工合成生物材料的优点[31]，先将天然材料木质素接枝 PLA 形成 LP 共聚物，把这种 LP 共聚物与人工合成材料 PLLA 混合[21]，成功使用静电纺丝技术获得网图 1-4 PLLA / LP 纳米纤维的表征结果图（A）蠕变和恢复应变时间曲线；（B）蠕变顺应性时间曲线。Fig.1-4 Characterization of PLLA/LP nanofibers: (A) creep and recovery strain time curves; (B)Creep compliance time curves.

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