趋化因子CXCL6与其受体CXCR2调控β-catenin促进骨肉瘤转移机制的研究

发布时间：2020-08-12 17:26

【摘要】：背景及目的:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种高度恶性肿瘤,10%-20%患者确诊时病灶已发生转移。由于骨肉瘤转移是一个复杂的病理过程,涉及到多种信号转导途径,因此,骨肉瘤高转移、高侵袭特性相关机制是人们长期关注的课题。近年来,人们试图通过探讨上皮细胞-间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)及其相关蛋白的作用,阐明恶性肿瘤转移的机制。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,可导致细胞对细胞的连接的丧失,以及对一个移动和迁移表型的获取,从而引起基底膜的侵入,最终可能导致转移。骨肉瘤是间叶组织源性的最常见的骨恶性肿瘤。虽然,以往的研究认为,EMT仅发生在上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞转移过程中,但随着研究的深入,有实验结果证实间质来源的肉瘤细胞或干细胞同样可通过改变EMT相关蛋白的表达增强转移。研究发现,骨肉瘤转移患者瘤体组织中相对高表达N-cadherin和Snail蛋白,相对低表达E-cadherin蛋白[150];同时,在多种骨肉瘤细胞系中,细胞可通过调节EMT相关蛋白的表达,增强细胞侵袭能力[140],[145],这些结果提示EMT不仅是上皮细胞来源肿瘤转移的关键步骤,人们认为在间质细胞来源的骨肉瘤中可能也同样存在EMT或EMT相关蛋白表达的改变,从而参与了骨肉瘤转移的形成机制。目前认为EMT的实质极有可能是肿瘤细胞通过信号转导实现获得转移能力的一种生命现象[157]。预示着EMT相关蛋白表达变化过程中存在更深层次的转录和表观遗传变异,因此,需要进一步探讨EMT相关蛋白在骨肉瘤细胞转移中的作用。迄今研究认为,作为吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量的多种趋化因子及相关受体参与了乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺导管细胞癌和肝癌等肿瘤细胞的浸润和转移[158-159]。骨肉瘤的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中存在大量巨噬细胞[152-153],巨噬细胞可通过分泌TNF-α、TNF-β、IL-lα、IL-1β诱导CXCL6表达[154]。同时,Li[120]等研究发现,CXCL6在骨肉瘤患者的血清中呈现高表达,且体外实验证实添加重组人CXCL6可显著促进骨肉瘤细胞的增殖。CXCL6的受体为CXCR1和CXCR2,其与CXCR2的结合力强于CXCR1,并且仅是CXCR2内化的强效诱导剂[155]。CXCR2除了参与肿瘤血管生成外,还与多种肿瘤细胞的EMT过程密切相关[121-123]。在CXCR2发挥促进EMT作用的多条信号通路中,PI3K/Akt相关报道最多。另一方面,β-catenin是经典Wnt/β-catenin信号通路的核心,研究发现,β-catenin可与E-cadherin形成复合物,该复合物可调控EMT,从而在肿瘤细胞增殖、侵袭转移等过程中发挥重要的作用。目前认为PI3K/Akt信号通路可通过抑制GSK-3β的活性,从而促进β-catenin的核转移,即PI3K/Akt信号通路可促进Wnt/β-catenin信号通路活化[147,148]。提示通过研究肿瘤细胞转移过程中PI3K/Akt信号与其他信号途径的交互调控机制,可能为阐明趋化因子调控骨肉瘤细胞转移机制提供了新的线索。综上所述,骨肉瘤的微环境中存在大量的巨噬细胞,它们可促进肿瘤细胞分泌CXCL6,且骨肉瘤患者血清中CXCL6呈高表达,此外,CXCL6可与具有EMT诱导作用的CXCR2特异性高效结合,由此可推测,趋化因子CXCL6与其受体CXCR2在骨肉瘤发生发展过程中,能够通过调节EMT相关蛋白的表达,提高骨肉瘤细胞的迁移、侵袭能力,从而促进骨肉瘤的转移。基于上述分析,本课题选择趋化因子CXCL6与其受体CXCR2为研究对象,探讨其对骨肉瘤细胞迁移、侵袭以及EMT相关蛋白的作用,并探究PI3K/Akt、β-catenin信号通路在趋化因子CXCL6介导的转移中的作用,以期能为骨肉瘤的复发及转移的早期诊断和治疗提供相关的理论和实践依据。本实验利用转移能力不同的四种骨肉瘤细胞系,确定趋化因子CXCL6及其受体CXCR2表达与骨肉瘤转移能力的相关性;利用CXCL6中和抗体,观察其对转移能力相对较强的MG63、143B细胞系转移能力及EMT相关蛋白的影响,确认趋化因子CXCL6及其受体CXCR2与骨肉瘤EMT相关蛋白之间的可能关系;同时,我们利用重组人CXCL6验证其能否影响转移能力相对较弱的Sa OS-2、U2OS细胞系的迁移、侵袭及EMT相关蛋白的表达,并在体内实验中进一步验证趋化因子CXCL6与其受体CXCR2对裸鼠骨肉瘤生长和肺转移的影响;最后利用PI3K/Akt和β-catenin信号通路阻滞剂、沉默CXCR2探讨趋化因子CXCL6与其受体CXCR2引起骨肉瘤患者发生肿瘤转移的机制。方法:1.利用TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱)中骨肉瘤(Osteosarcoma)的数据,采用R语言软件进行统计分析,利用Fisher.test函数进行Fisher精确检验,分析CXCL6、CXCR2m RNA的表达与骨肉瘤患者发生肿瘤转移的相关性;2.采用RT-PCR、Western blot法检测四种骨肉瘤细胞系MG63、143B、Sa OS-2及U2OS细胞中CXCL6、CXCR2的表达情况,并采用Transwell法检测上述骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭能力的强弱与CXCL6表达高低的关系;3.以重组人CXCL6处理骨肉瘤细胞MG63、143B、Sa OS-2及U2OS,利用CCK-8法检测细胞的存活情况;4.以CXCL6中和抗体处理MG63、143B细胞,利用Transwell法检测细胞迁移和侵袭情况,应用Western blot法检测E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白的表达情况,应用免疫荧光检测E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达和分布情况。5.采用si RNA技术沉默Sa OS-2、U2OS细胞中CXCR2,并以重组人CXCL6处理细胞,利用Transwell法检测细胞迁移和侵袭情况,免疫荧光检测细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达;Western blot检测细胞中MMP-9、Snail、phospho-Akt Ser473、Akt、核β-catenin蛋白的表达。应用LY294002和XAV939阻滞PI3K/Akt和β-catenin信号通路,并以重组人CXCL6处理细胞,通过采用Transwell法和Western blot法,考察细胞迁移、侵袭和EMT相关蛋白表达的情况。6.为了验证CXCL6促进骨肉瘤转移的作用,我们选取了CXCL6表达与转移性较低的U2OS细胞,通过慢病毒感染U2OS细胞,构建并筛选高表达CXCL6的U2OS细胞,利用高表达CXCL6的U2OS细胞建立裸鼠皮下荷瘤模型和尾静脉肺转移模型。给予裸鼠腹腔注射CXCR2拮抗剂SB225002,利用肿瘤生长曲线、瘤体质量、免疫组化法及Western blot法,考察趋化因子CXCL6与其受体CXCR2对肿瘤生长和增殖的调控作用;利用肺组织HE染色观察肺转移情况,考察趋化因子CXCL6与其受体CXCR2对肿瘤转移的调控作用。结果:1.提取TCGA(TCGA data version 2016_01_28 for SARC)中同时具有临床信息与CXCL6和CXCR2m RNA的表达信息的骨肉瘤病例266例,其中175例患者具有转移的信息,利用Fisher精确检验,结果显示,CXCL6与其受体CXCR2在m RNA表达水平上呈正相关(P=0.0006)。同时,CXCL6m RNA表达与患者发生转移显著相关(P=0.009645)。2.四种骨肉瘤细胞株中CXCL6、CXCR2在基因水平和蛋白水平均呈高表达,同时,CXCL6表达越高,细胞的迁移和侵袭能力越强。3.CCK-8检测结果显示,重组人CXCL6(100ng/ml)处理MG63、143B、Sa OS-2及U2OS细胞48h后,与空白对照组相比较,细胞增殖能力明显增强(P㩳0.05)。4.CXCL6中和抗体能够降低骨肉瘤细胞MG63、143B迁移和侵袭能力,同时使细胞中EMT相关蛋白Snail、N-cadherin的表达明显降低,E-cadherin蛋白的表达明显的升高。5.在CXCR2基因沉默后,重组人CXCL6促进Sa OS-2、U2OS细胞的迁移和侵袭的效果明显降低,同时EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin以及信号通路相关蛋白p-Akt/Akt和核β-catenin的相对表达量受重组人CXCL6的影响也显著减小;加入LY294002和XAV939信号通路阻滞剂后,Sa OS-2、U2OS细胞中MMP-9、Snail和N-cadherin的表达明显减少,E-cadherin的表达显著增加。6.动物实验结果显示,皮下注射CXCL6高表达的U2OS细胞可促进肿瘤的生长及瘤体中的增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、p-Akt/Akt及胞核β-catenin蛋白等的表达,而注射CXCR2拮抗剂后,细胞增殖蛋白PCNA、p-Akt/Akt和胞核β-catenin蛋白的相对表达量均降低。在肺转移模型中,CXCL6可显著促进肿瘤细胞肺转移,注射CXCR2拮抗剂后,肺部转移灶明显减少。高表达CXCL6能够增加成瘤率与肺部转移率,同时,增加肺部组织转移灶的形成;给予CXCR2拮抗剂后,虽然肺部转移率并未见明显变化,但是,其病理学实验结果显示肺部组织转移灶的形成明显减少。结论:1通过TCGA数据分析以及趋化因子CXCL6差异表达的四种骨肉瘤细胞迁移、侵袭实验检测,我们推测骨肉瘤趋化因子CXCL6的表达可能与转移能力有关;2利用CXCL6中和抗体或沉默趋化因子受体CXCR2能够抑制骨肉瘤细胞趋化因子CXCL6介导的转移能力,并改变EMT相关蛋白的表达。表明趋化因子CXCL6与其受体CXCR2结合,可以调控EMT相关蛋白的表达,从而引起骨肉瘤细胞发生转移。3用PI3K/Akt和β-catenin信号通路阻滞剂能够阻断趋化因子CXCL6引起的EMT相关蛋白表达。提示趋化因子CXCL6与其受体CXCR2可能通过调控PI3K/Akt和β-catenin信号通路,引起EMT相关蛋白表达的变化,参与了骨肉瘤转移的机制。4体内实验验证了趋化因子CXCL6与其受体CXCR2能够影响骨肉瘤在裸鼠皮下生长与肺转移,进一步支持趋化因子CXCL6与其受体CXCR2通过调控PI3K/Akt与β-catenin信号通路参与了骨肉瘤的转移。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1
【图文】：

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