WNT5A信号通路调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭的机制研究
发布时间：2020-08-22 03:57
【摘要】：目的:作为一种非经典WNT信号通路中具有代表性的配体,WNT5A在肿瘤发生和肿瘤抑制中发挥着重要作用。已有研究表明,非受体酪氨酸激酶SRC在WNT5A引起的骨肉瘤细胞侵袭中具有一定作用。然而,WNT5A/SRC信号调控骨肉瘤细胞侵袭作用的详细分子机制仍不十分清楚。本研究的目的是探索ERK1/2在WNT5A/SRC引起骨肉瘤细胞侵袭中的作用,以及SRC/ERK1/2信号通路的下游靶点。方法:本研究使用人体骨肉瘤MG-63细胞系,体外实验包括划痕愈合试验、Transwell迁移和侵袭实验等。另外,还包括小干扰RNA(siRNA)转染实验,蛋白质免疫印迹实验以及免疫荧光实验。结果:我们发现WNT5A(100 ng/mL)能够明显刺激MG-63细胞的迁移和侵袭,而通过使用siRNA沉默SRC或者通过使用PD98059抑制ERK1/2的磷酸化作用可以抑制迁移和侵袭作用,这就表明SRC和ERK1/2的活化作用对WNT5A引起的MG-63细胞的迁移和侵袭作用是必要的。而且,WNT5A引起的ERK1/2磷酸化作用可以被SRC siRNA显著抑制。另外,我们的研究进一步表明,WNT5A处理可以使MG-63细胞的MMP-14表达上调,且其上调能够被SRC siRNA或PD98059抑制。结论:综上所述,WNT5A能够活化SRC/ERK1/2信号通路,从而引起MMP-14表达的上调以及骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1
【图文】：
第三章 实验结果3.1 WNT5A 促进人类骨肉瘤 MG-63 细胞的迁移和侵袭为了探索 WNT5A 对 MG-63 细胞迁移和侵袭的作用,我们使用不同浓度（0、50、100 和 200 ng/ml）的 rWNT5A 处理 MG-63 细胞，然后用划痕愈合实验、Transwell 迁移和侵袭实验来检测细胞的迁移和侵袭能力。结果显示，WNT5A 明显增强了细胞的迁移能力（见图 1A）。当使用 100 ng/ml 的 rWNT5A 处理时，MG-63 细胞的迁移能力较未处理组相比大约增加了两倍(见图 1B，1C)，而当浓度较低（50 ng/ml）时促进作用并不明显（见图 1A 1C）。这些结果与另一个实验室的观察结果是一致的[25]。我们同样观察到 rWNT5A 对 MG-63 细胞侵袭能力的影响有类似的效果（见图 1A，1D）。因此，我们得出结论，WNT5A 可以促进人体骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭。相应地，我们选择100 ng/ml的rWNT5A来研究 WNT5A 促进 MG-63 细胞迁移和侵袭的分子机制。
兰州大学硕士学位论文 WNT5A信号通路调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭的机制研究3.2 SRC 激酶在 WNT5A 促进 MG-63 细胞迁移和侵袭中的作用。为了确认 SRC 是否能够被 WNT5A 激活，以时间依赖的方式（0、1、5、15、30 和 60 min）将 MG-63 细胞暴露于 WNT5A（100 ng/ml）中。然后，使用蛋白免疫印迹法检测 SRC 在 Tyr416 位点的磷酸化水平（p-Tyr416 SRC，即 SRC 的激活状态）。结果发现，SRC 的磷酸化水平在 1 分钟内迅速增加，并在 5 分钟时达到峰值（见图 2A，2B）。接下来，我们使用蛋白免疫印迹法来检测 SRC siRNA 的沉默效率。与对照组和 non-silencing siRNA 组相比，SRC siRNA 转染组细胞的 SRC 的表达水平显著下降（见图 3A，3B）。WNT5A 在 SRC siRNA 转染的细胞中不能明显地促进SRC 的活化（见图 5A，5C）。而且我们发现，与对照组相比，SRC siRNA 转染可导致 MG-63 细胞迁移和侵袭能力的下降，并显著抑制由 WNT5A 引起的迁移和侵袭作用（见图 5G 5I）。
WNT5A信号通路调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭WNT5A 对 ERK1/2 的磷酸化作用被 PD98059 以剂量依0 μM 的 PD98059 显著抑制 ERK1/2 的磷酸化（见图 4A明ERK1/2参与到WNT5A诱导的MG-63细胞的迁移和处理 MG-63 细胞，然后加入 WNT5A。结果显示，与显抑制了细胞的迁移（见图 5G，5H）和侵袭（见图 NT5A 诱导的迁移和侵袭（见图 5G-5I）。
本文编号：2800235
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1
【图文】：
第三章 实验结果3.1 WNT5A 促进人类骨肉瘤 MG-63 细胞的迁移和侵袭为了探索 WNT5A 对 MG-63 细胞迁移和侵袭的作用,我们使用不同浓度（0、50、100 和 200 ng/ml）的 rWNT5A 处理 MG-63 细胞，然后用划痕愈合实验、Transwell 迁移和侵袭实验来检测细胞的迁移和侵袭能力。结果显示，WNT5A 明显增强了细胞的迁移能力（见图 1A）。当使用 100 ng/ml 的 rWNT5A 处理时，MG-63 细胞的迁移能力较未处理组相比大约增加了两倍(见图 1B，1C)，而当浓度较低（50 ng/ml）时促进作用并不明显（见图 1A 1C）。这些结果与另一个实验室的观察结果是一致的[25]。我们同样观察到 rWNT5A 对 MG-63 细胞侵袭能力的影响有类似的效果（见图 1A，1D）。因此，我们得出结论，WNT5A 可以促进人体骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭。相应地，我们选择100 ng/ml的rWNT5A来研究 WNT5A 促进 MG-63 细胞迁移和侵袭的分子机制。
兰州大学硕士学位论文 WNT5A信号通路调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭的机制研究3.2 SRC 激酶在 WNT5A 促进 MG-63 细胞迁移和侵袭中的作用。为了确认 SRC 是否能够被 WNT5A 激活，以时间依赖的方式（0、1、5、15、30 和 60 min）将 MG-63 细胞暴露于 WNT5A（100 ng/ml）中。然后，使用蛋白免疫印迹法检测 SRC 在 Tyr416 位点的磷酸化水平（p-Tyr416 SRC，即 SRC 的激活状态）。结果发现，SRC 的磷酸化水平在 1 分钟内迅速增加，并在 5 分钟时达到峰值（见图 2A，2B）。接下来，我们使用蛋白免疫印迹法来检测 SRC siRNA 的沉默效率。与对照组和 non-silencing siRNA 组相比，SRC siRNA 转染组细胞的 SRC 的表达水平显著下降（见图 3A，3B）。WNT5A 在 SRC siRNA 转染的细胞中不能明显地促进SRC 的活化（见图 5A，5C）。而且我们发现，与对照组相比，SRC siRNA 转染可导致 MG-63 细胞迁移和侵袭能力的下降，并显著抑制由 WNT5A 引起的迁移和侵袭作用（见图 5G 5I）。
WNT5A信号通路调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭WNT5A 对 ERK1/2 的磷酸化作用被 PD98059 以剂量依0 μM 的 PD98059 显著抑制 ERK1/2 的磷酸化（见图 4A明ERK1/2参与到WNT5A诱导的MG-63细胞的迁移和处理 MG-63 细胞，然后加入 WNT5A。结果显示，与显抑制了细胞的迁移（见图 5G，5H）和侵袭（见图 NT5A 诱导的迁移和侵袭（见图 5G-5I）。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 ;Wnt5a participates in hepatic stellate cell activation observed by gene expression profile and functional assays[J];World Journal of Gastroenterology;2012年15期
本文编号：2800235
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/waikelunwen/2800235.html
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