负载PRF的新型水凝胶对骨髓间充质干细胞体外成软骨分化影响的研究

发布时间：2020-08-25 06:57

【摘要】：目的探究负载富血小板纤维蛋白(Platelet-Rich Fibrin,PRF)的新型水凝胶的制备方法及相关性质,并观察该水凝胶对兔骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal StemCells,BMSCs)体外成软骨分化的影响,为临床进行软骨缺损的修复提供一种新的水凝胶支架。方法首先制备结合京尼平的壳聚糖温敏水凝胶。将2%(w/v)壳聚糖(Chitosan,CS)溶液、56%(w/v)β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,β-GP)溶液以及 0.1%(w/v)或0.05%(w/v)京尼平溶液按不同体积比混合得到CS/GP、CS/GP/京尼平混合溶液,分别检测它们在37℃时的成胶时间,观察大体强度以及体外降解情况;将水凝胶制备成冻干支架后进行扫描电镜观察(Scanning Electron Microscope,SEM)、傅里叶红外光谱分析(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR)、溶胀度检测。再通过一次离心法制备PRF,将PRF冻干后研磨成粉加入上述水凝胶的混合液中,观察该负载PRF的新型水凝胶体外TGF-βl、IGF-l的缓释情况,并通过CCK-8(CellCounting Kit-8)法检测负载PRF的水凝胶冻干支架浸提液的细胞毒性。最后,将BMSCs接种于含有水凝胶的12孔板中,通过二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate,FDA)荧光染色观察细胞生长情况;再接种BMSCs于24孔板中,进行成软骨诱导的同时加入负载PRF的新型水凝胶、壳聚糖温敏水凝胶以及空白对照,培养2周后通过HE染色、番红O-固绿染色、阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色以及采用阿利新蓝比色法定量检测上清液糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)含量、ELISA竞争法定量检测上清液Ⅱ型胶原含量,观察负载PRF的新型水凝胶对BMSCs成软骨分化的影响情况。结果体积比为6:1:1的CS/GP/0.1%京尼平混合液能够在37℃下8分钟左右形成大体强度为5级的水凝胶;该水凝胶在37℃体外环境下,第7周左右可达到完全降解;SEM结果显示冻干支架内部呈海绵状多孔结构;傅里叶红外光谱分析显示京尼平与CS发生了交联作用;溶胀度为(404.62±105.39)%,提示吸水性良好。TGF-β1、IGF-1等生长因子缓释检测结果显示,负载PRF的新型水凝胶与PRF缓释生长因子的能力大致相当,差异无明显统计学意义(P0.05);细胞相容性检测结果显示负载PRF的新型水凝胶具有良好的细胞相容性。FDA荧光染色显示BMSCs在水凝胶表面增殖良好;软骨相关染色结果显示负载PRF的新型水凝胶组染色结果均呈阳性,而壳聚糖温敏水凝胶组和空白对照组呈弱阳性;三组上清液均含有GAGs和Ⅱ型胶原,负载PRF的新型水凝胶分泌量在四周内均高于其他两组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论采用体积比为6:1:1的CS/GP/0.1%京尼平的混合溶液能够形成理化性质较好的壳聚糖温敏水凝胶;负载PRF的新型水凝胶能够以一定速率缓释生长因子,该水凝胶具有良好的细胞相容性,并能在一定程度上促进BMSCs成软骨分化,具有在软骨组织工程领域的应用前景。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08;R68
【图文】：

照片,温敏水凝胶,壳聚糖,照片

第二章逦负载ＰＲＦ的新型水凝胶对骨髓间充质干细胞体外成软骨分化影响的研宄逡逑３结果逡逑３．１试管倒置法确定成胶情况逡逑室温下ＣＳ／ｐ－ＧＰ混合溶液呈白色透明、可流动的液态（图ｌａ）；置于３７°Ｃ邋—逡逑定时间后即可转变为乳白色不透明、流动性降低的凝胶态（图ｌｂ）。添加京尼平的逡逑水凝胶以其京尼平浓度的由低到高呈现出由淡蓝变为深蓝的情况。我们实验中还观察逡逑到添加０．０５％京尼平的水凝胶初期为淡蓝色，放置一段时间后转变为浅褐色；添加逡逑０．１％京尼平的水凝胶则始终呈现为深蓝色。逡逑

照片,温敏水凝胶,成胶时间,壳聚糖

图１壳聚糖温敏水凝胶照片逡逑３．２水凝胶的成胶时间及大体强度观察逡逑由图２可看出，壳聚糖在配方中的含量是影响水凝胶成胶与否及成胶时间的主要逡逑因素。京尼平的加入并未对水凝胶的成胶时间产生明显的影响，而根据自制的壳聚糖逡逑温敏水凝胶大体强度结果（表２）可看出，京尼平的含量与水凝胶的强度呈正相关，逡逑即京尼平含量越高，所形成的水凝胶强度越强。壳聚糖所占比例也在一定程度上影响逡逑水凝胶的强度：壳聚糖含量越高，水凝胶强度越大。逡逑此外，当壳聚糖所占比例低于３时，混合液在３７°Ｃ中无论放置多久均无明显成逡逑胶迹象；而当壳聚糖所占比例高于８时，成胶时间均在３０ｍｉｎ以上，由于成胶时间过逡逑长，对于软骨修复方面的应用受到较大限制。逡逑１４逡逑

水凝胶,强度,成胶

逦第二章逡逑典型图片见图３。ａ和ｂ示Ａ７水凝胶大体强度观，可被夹起，但强度较差；ｃ和逡逑ｄ示加入０．０５％京尼平的Ｂ８水凝胶大体强度观，可被夹起甚至稍用力挤压；ｅ和ｆ示逡逑加入０．１％京尼平的Ｃ６水凝胶大体强度观，不仅可被夹起，还能用刀切割塑形。逡逑根据水凝胶强度、成胶时间等指标进行综合分析后决定本实验后期采用Ａ７、Ｂ８、逡逑Ｃ６水凝胶配方进行进一步研究。逡逑逦表２各组水凝胶的成胶时间及大体强度分级逦逡逑Ａ组逦成胶逦大体强逦Ｂ组逦成胶逦大体强逦Ｃ组逦成胶逦大体强度逡逑Ａ１逦不成胶逦0级逦Ｂ１逦不成胶逦0级逦Ｃ１逦不成胶逦0级逡逑Ａ２逦不成胶逦0级逦Ｂ２逦不成胶逦0级逦Ｃ２逦不成胶逦0级逡逑Ａ３逦不成胶逦0级逦Ｂ３逦不成胶逦0级逦Ｃ３逦不成胶逦0级逡逑Ａ４逦３，４９”逦１逦级逦Ｂ４逦５’２９”逦２逦级逦Ｃ４逦４’１８’逦２逦级逡逑Ａ５逦７，２４”逦１逦级逦Ｂ５逦７’３１”逦２逦级逦Ｃ５逦６’２８”逦３逦级逡逑Ａ６逦９’０”逦２逦级逦Ｂ６逦１０’０３”逦３逦级逦Ｃ６逦８’３４”逦４逦级逡逑Ａ７逦１７’３２，，逦３逦级逦Ｂ７逦１７’１８’，逦３逦级逦Ｃ７逦１７’０３”逦４逦级逡逑Ａ８逦３１，３３”逦３逦级逦Ｂ８逦２８’１８”逦４逦级逦Ｃ８逦３１’５５”逦４逦级逡逑Ａ９逦６７，逦３逦级逦Ｂ９逦６８’逦４逦级逦Ｃ９逦６４

【参考文献】