表没食子儿茶素没食子酸酯对人骨肉瘤细胞的抑制作用及其机制探讨

发布时间：2020-08-26 03:09

【摘要】：目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对人骨肉瘤细胞的抑制作用,并初步探讨其可能的分子生物学机制。方法:骨肉瘤(143B、MG63、SaOS2)三种细胞株,各自采用含0~50μmol/L的EGCG培养基培养后,使用MTT法检测EGCG对三株细胞的增殖活性的影响,集落形成试验检测EGCG对143B细胞集落形成能力影响。应用流式细胞仪和Hoechst染色法分析细胞凋亡情况,采用划痕愈合实验以及Transwell小室法观察细胞迁移能力变化。蛋白印迹法检测细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、PARP、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP);增殖相关的蛋白(PCNA);迁移相关蛋白(MMP-9、Vimentin、E-cadherin)的表达水平变化。采用荧光素酶报告基因系统分析细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活化情况,采用蛋白印迹法检测Wnt/β-catenin信号通路中关键因子β-catenin及其下游靶分子C-myc、CyclinD1、MMP-7蛋白的表达情况。构建骨肉瘤裸鼠模型,采取灌胃给药,观察EGCG对骨肉瘤影响,免疫组化检测瘤体β-catenin、PCNA的表达,以及对肺组织和骨组织HE染色,观察骨肉瘤的侵袭能力。结果:EGCG处理骨肉瘤细胞后,三株骨肉瘤细胞的增殖能力明显抑制,其中143B细胞的集落形成能力和迁移能力均被明显抑制(P值均0.05),且凋亡细胞数明显增加(P0.05)。细胞中增殖蛋白PCNA表达降低(P0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP表达降低(P值均0.05),Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表达水平均明显上调(P值均0.05);迁移相关蛋白MMP-9、Vimentin表达随浓度的增加逐渐降低(P值均0.05),而E-cadherin表达逐渐升高(P0.05);Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、C-myc、CyclinD1、MMP-7、p-GSK-3β的蛋白表达均水平明显下调(P值均0.05),GSK-3β蛋白表达无明显变化(P0.05)。此外,EGCG处理组的荧光素酶活性值较未处理组明显下降(P0.05)。动物实验结果显示:随着灌胃浓度的提高,瘤体生长速率和体积得到明显抑制(P0.05),免疫组化结果显示实验组较对照组β-catenin、PCNA表达降低。HE染色结果显示对照组肺部转移和瘤体对骨组织的侵犯明显,实验组随着EGCG剂量增加肺部转移和对骨组织的侵犯得到明显抑制。结论:EGCG能抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡,并且这一系列作用可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738
【图文】：

图 2.1 EGCG 作用骨肉瘤细胞和人骨髓基质细胞后 MTT 检测细胞增殖能力Fig2.1 Effect of EGCG on Cell Proliferation by Osteoclastoma Cells and Human Bone MarrowStromal Cells after MTTAssay. (A)Effect of EGCG on 143B cell Proliferation. (B)Effect ofEGCG on MG63 cell Proliferation. (C)Effect of EGCG on SaOS2 cell Proliferation. (D)Effectof EGCG on HS-5 cell Proliferation2.2 EGCG 显著抑制人骨肉瘤细胞 143B 的集落形成能力检测 EGCG 是否能有效抑制骨肉瘤细胞的克隆形成能力，采用了平板克隆形成实验，结果表明(图 2.2A)培养 10d 后 Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L组克隆形成率分别为：（78.13±9.11）%、（53±12.31）%、（8.21±2.01）%、（2.01±0.51）%，说明 EGCG 在较低浓度情况下能有效抑制骨肉瘤细胞的集落形成能力（P<0.05）。

图 2.2 EGCG 作用于骨肉瘤 143B 细胞后集落形成实验Fig2.2 Effect of EGCG on colony-formation of osteosarcoma 143B cells2.3 EGCG 对骨肉瘤细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示（图 2.3A）：Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L 细胞凋亡率分别为（12.12±1.41）%（14.42±3.03）%、（18.56±3.91）%、（19.12±4.71）%、（41.12±4.56）%、（59.12±6.94）%；Hoechst 染色显示（图 2.3B）：各浓度组细胞凋亡率分别为（11.03±1.01）%（13.12±1.04）%、（14.96±0.91）%、（21.02±2.91）%、（39.12±5.06）%、（63.12±5.94）%。两项实验结果均表明随着 EGCG 浓度的增加，细胞的凋亡率明显增加，EGCG 浓度大于40μmol/L 时具有统计学意义（P＜0.05）。实验表明 EGCG 在浓度大于 40μmol/L 可有效诱导 143B 细胞凋亡并呈现出浓度依耐性。

图 2.2 EGCG 作用于骨肉瘤 143B 细胞后集落形成实验Fig2.2 Effect of EGCG on colony-formation of osteosarcoma 143B cells2.3 EGCG 对骨肉瘤细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示（图 2.3A）：Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L 细胞凋亡率分别为（12.12±1.41）%（14.42±3.03）%、（18.56±3.91）%、（19.12±4.71）%、（41.12±4.56）%、（59.12±6.94）%；Hoechst 染色显示（图 2.3B）：各浓度组细胞凋亡率分别为（11.03±1.01）%（13.12±1.04）%、（14.96±0.91）%、（21.02±2.91）%、（39.12±5.06）%、（63.12±5.94）%。两项实验结果均表明随着 EGCG 浓度的增加，细胞的凋亡率明显增加，EGCG 浓度大于40μmol/L 时具有统计学意义（P＜0.05）。实验表明 EGCG 在浓度大于 40μmol/L 可有效诱导 143B 细胞凋亡并呈现出浓度依耐性。

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本文编号：2804592