JQ1诱导移植心脏存活的机制研究
发布时间：2020-09-30 21:35
背景:器官移植是解决多种器官终末期疾病的最佳选择,而移植耐受也是移植领域工作者的一大研究方向。近年来,各种研究表明小分子抑制剂JQ1在各个领域都有重要作用,尤其是在抑制炎症反应方面。然而目前尚未有关于JQ1在移植领域的研究。自噬作为细胞降解不必要的底物包括受损的细胞器、错误折叠蛋白和病原体等的过程,对维持细胞稳态有着重要的生理学意义,并且与炎症有密切的关系。实验目的:探究小分子化合物JQ1是否具有延长移植心脏存活的作用。并且进一步分析JQ1对心肌细胞,各种炎症相关因子以及免疫细胞的影响,以进一步研究其机制。材料与方法:将野生型C57BL/6小鼠随机分成两组作为心脏供体,以Balb/c小鼠作为受体,建立同种异基因异位心脏移植模型,移植后两组分别注射对照溶液,JQ1溶液。一部分小鼠用于观察移植后心脏的存活时间,其余小鼠于术后3、5、7天分别安乐处死,取移植心脏样本做苏木精—伊红染色(HE)染色观察组织结构及炎症浸润情况,细胞因子微球检测技术检测供体心脏中的炎症相关的细胞因子表达情况,Western Blot检测自噬通路上各蛋白变化,透射电镜观察心肌细胞中自噬小体的数量,并用流式细胞技术检测两组中主要免疫细胞的变化。之后通过Baflomycin A1(BafA1)阻断自噬、他莫昔芬诱导的Cre/loxP重组酶系统构建的心肌特异性ATG5基因敲除小鼠证明JQ1通过自噬通路影响移植心脏的存活时间。结果:研究表明,JQ1能够有效的延长移植后心脏的存活时间。HE染色显示,术后第7天,J Q1组小鼠心脏组织完整性较对照组好,且炎症细胞浸润明显减少。Western Blot实验发现,JQ1组的LKB1水平明显上调,AMPK激酶的磷酸化水平、ULK1磷酸化水平、ATG14磷酸化水平、ATG5-ATG12复合物水平以及LC3Ⅱ明显升高。与之一致的是,电镜下观察发现,JQ1组自噬小体明显多于对照组。BafA1与JQ1联用组相比于JQ1单用组,存活时间明显下降,接近于对照组水平。同时,我们发现供体心肌细胞中ATG5特异性敲除后,使用JQ1处理,存活时间较JQ1单用组下降,接近对照组。同时,JQ1组心肌组织中IL-1β,IL-2,IL-6,TNF-α,IFN-γ,IL-17等炎症因子在术后3、5、7天时相比于对照组均有不同程度的下降。并且,在阻断自噬之后再使用JQ1,IL-1β,IL-6,TNF-α,IFN-γ的水平较JQ1单用组升高明显。此外,我们发现,JQ1组较对照组,脾脏中Treg水平下降,而外周血、心肌组织浸润的Treg水平不变,而在体外实验中,JQ1组处理的Th1,Th2,Th17及Treg细胞的增值分化水平明显低于对照组。JQ1组与对照组脾脏中CD4+CD69+与CD8+CD69+T细胞水平没有明显变化。结论:JQ1能够显著延长移植后小鼠移植心脏的存活时间,机制为JQ1通过LKB1-AMPK-ULK1通路,促进自噬,从而抑制炎症,使移植心脏存活时间延长。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R654.2
【部分图文】：
浙江大学硕士学位论文逦逡逑３结果逡逑３．１邋ＪＱ１能够延长移植心脏的存活时间逡逑从移植术后开始，ＪＱ１组小鼠每天腹腔注射配置好的ＪＱ１溶液（剂量：逡逑２５ｍｇ／ｋｇ）至第七天，对照组则注射相同剂量的对照溶液。每天观察及触摸颈逡逑部心脏的跳动情况并记录。实验结果显示，Ｂａｌｂ／ｃ—Ｂａｌｂ／ｃ组小鼠可以无限存逡逑活，说明手术操作没有问题。ＪＱ１组小鼠的平均存活时间为（１９．１４邋士邋４．５８）天，逡逑相比于对照组的（８．２５邋士邋０．９７）天显著延长了，并且两组比较存在统计学意义逡逑（图１Ａ）。之后，取移植术后第７天的心脏标本，ＨＥ染色，镜下观察可见：逡逑ＪＱ１组小鼠移植心脏组织结构相对完整，炎症细胞浸润也较少，而对照组移植逡逑心脏中，组织结构破坏明显，同时有大量的炎症细胞浸润（图１Ｂ）。说明，ＪＱ１逡逑在移植术后对心脏的组织结构具有保护作用。逡逑
的方法检测了移植心脏中细胞自噬的水平。首先，我们做了蛋白质印迹（ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ），发现心肌组织中自噬相关蛋白ＡＴＧ５－ＡＴＧ１２复合物与ＬＣ３ＩＩ在ＪＱ１组明显逡逑高于对照组（图２Ａ）。此外，我们在透射电镜下观察到，ＪＱ１组的自噬小体数量明逡逑显多于对照组，且有明显的统计学差异（Ｐ＜0．000ｌ）（图２Ｂ，２Ｄ），结合ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ逡逑的数据，我们可以得出，ＪＱ１促进了心肌细胞的自噬。为了验证在移植之后，心肌逡逑细胞的自噬被诱导，我们取了未移植的心脏组织做空白对照，发现对照组相比于逡逑空白组，心肌细胞中自噬小体增多，这说明了移植之后，自噬较基础水平增加。逡逑此外，我们意外的发现，心肌组织中，ＪＱ１组ＬＫＢ１的ｍＲＮＡ水平与对照组逡逑相比明显升高，并且有显著的统计学差异（ｐ＝0．00６１）（图２Ｃ）。随后我们用ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ的方法，检测了邋ＬＫＢ１的蛋白水平变化，发现结果与ＲＴ－ＰＣＲ的结果一致，ＪＱ１逡逑组的ＬＫＢ１明显多于对照组。ＬＫＢ１作为ＡＭＰＫ上游的重要激酶
植心脏存活的作用。结果显示，ＢａｆＡｌ单用组相比于对照组存活时间缩短，说明逡逑抑制自噬能够缩短存活时间，而ＪＱｌ＋ＢａｆＡｌ组与ＪＱ１组比较，存活曲线明显缩短，逡逑接近对照组水平但仍稍高于对照组（图３Ａ）。这说明，自噬被药物全身性阻断后，逡逑ＪＱ１的作用大大减弱，甚至消失。逡逑Ａ逡逑１００－１逦ｐ－｜逦１逦ｏ逡逑Ｉ邋８０－邋＂Ｕ逦＋邋ＪＱ１（ｎ＝７）逦ｔ逡逑１逦６０－邋＇ｈ邋Ｔ邋１逦Ｃ。—，８）邋ｊ邋、逡逑ｓ邋４０－逦ｈ逦＋邋ＪＱ１＋ＢａｆＡ１（ｎ＝７）逡逑备逦Ｌ逦１逦邋令邋Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝６）逡逑２０－邋ｉｎ逡逑逦１￣%迹
本文编号：2831425
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R654.2
【部分图文】：
浙江大学硕士学位论文逦逡逑３结果逡逑３．１邋ＪＱ１能够延长移植心脏的存活时间逡逑从移植术后开始，ＪＱ１组小鼠每天腹腔注射配置好的ＪＱ１溶液（剂量：逡逑２５ｍｇ／ｋｇ）至第七天，对照组则注射相同剂量的对照溶液。每天观察及触摸颈逡逑部心脏的跳动情况并记录。实验结果显示，Ｂａｌｂ／ｃ—Ｂａｌｂ／ｃ组小鼠可以无限存逡逑活，说明手术操作没有问题。ＪＱ１组小鼠的平均存活时间为（１９．１４邋士邋４．５８）天，逡逑相比于对照组的（８．２５邋士邋０．９７）天显著延长了，并且两组比较存在统计学意义逡逑（图１Ａ）。之后，取移植术后第７天的心脏标本，ＨＥ染色，镜下观察可见：逡逑ＪＱ１组小鼠移植心脏组织结构相对完整，炎症细胞浸润也较少，而对照组移植逡逑心脏中，组织结构破坏明显，同时有大量的炎症细胞浸润（图１Ｂ）。说明，ＪＱ１逡逑在移植术后对心脏的组织结构具有保护作用。逡逑
的方法检测了移植心脏中细胞自噬的水平。首先，我们做了蛋白质印迹（ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ），发现心肌组织中自噬相关蛋白ＡＴＧ５－ＡＴＧ１２复合物与ＬＣ３ＩＩ在ＪＱ１组明显逡逑高于对照组（图２Ａ）。此外，我们在透射电镜下观察到，ＪＱ１组的自噬小体数量明逡逑显多于对照组，且有明显的统计学差异（Ｐ＜0．000ｌ）（图２Ｂ，２Ｄ），结合ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ逡逑的数据，我们可以得出，ＪＱ１促进了心肌细胞的自噬。为了验证在移植之后，心肌逡逑细胞的自噬被诱导，我们取了未移植的心脏组织做空白对照，发现对照组相比于逡逑空白组，心肌细胞中自噬小体增多，这说明了移植之后，自噬较基础水平增加。逡逑此外，我们意外的发现，心肌组织中，ＪＱ１组ＬＫＢ１的ｍＲＮＡ水平与对照组逡逑相比明显升高，并且有显著的统计学差异（ｐ＝0．00６１）（图２Ｃ）。随后我们用ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ的方法，检测了邋ＬＫＢ１的蛋白水平变化，发现结果与ＲＴ－ＰＣＲ的结果一致，ＪＱ１逡逑组的ＬＫＢ１明显多于对照组。ＬＫＢ１作为ＡＭＰＫ上游的重要激酶
植心脏存活的作用。结果显示，ＢａｆＡｌ单用组相比于对照组存活时间缩短，说明逡逑抑制自噬能够缩短存活时间，而ＪＱｌ＋ＢａｆＡｌ组与ＪＱ１组比较，存活曲线明显缩短，逡逑接近对照组水平但仍稍高于对照组（图３Ａ）。这说明，自噬被药物全身性阻断后，逡逑ＪＱ１的作用大大减弱，甚至消失。逡逑Ａ逡逑１００－１逦ｐ－｜逦１逦ｏ逡逑Ｉ邋８０－邋＂Ｕ逦＋邋ＪＱ１（ｎ＝７）逦ｔ逡逑１逦６０－邋＇ｈ邋Ｔ邋１逦Ｃ。—，８）邋ｊ邋、逡逑ｓ邋４０－逦ｈ逦＋邋ＪＱ１＋ＢａｆＡ１（ｎ＝７）逡逑备逦Ｌ逦１逦邋令邋Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝６）逡逑２０－邋ｉｎ逡逑逦１￣%迹
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