TGF-β1信号通路调控SYT-SSX1诱导滑膜肉瘤干性特征的初步研究

发布时间：2020-10-14 01:15

　　 目的:本研究通过体外实验,初步研究SYT-SSX1融合基因对滑膜肉瘤(synovial sarcoma,SS)球体细胞(sphere)的影响,探讨TGF-β1信号通路调控SYT-SSX1对滑膜肉瘤干细胞样细胞的作用,为进一步研究滑膜肉瘤肿瘤干细胞靶向治疗提供一定理论基础。方法:用SYT-SSX1融合基因慢病毒转染滑膜肉瘤SW982细胞,构建SYT-SSX1高表达细胞系,One step RT-PCR检测SYT-SSX1 m RNA表达。无血清悬浮方法培养sphere。运用q RT-PCR、WesternBlot、流式细胞仪检测转染前后CSC标记物m RNA及蛋白表达,Transwell实验检测转染前后球细胞的迁移能力。TGF-β1重组剂和抑制剂SB431542处理SYT-SSX1高表达和对照组sphere细胞。运用q RT-PCR、Western-Blot、流式细胞仪检测各组CSC标记物m RNA及蛋白表达,运用正态性检验、t检验等进行统计学分析,P0.05表示差异有统计学意义。结果:(1)通过无血清悬浮方法培养后,发现SYT-SSX1型高表达细胞比未处理组细胞成球数目多,体积大,成球率高,差异有统计学意义(P0.01,P0.001),表明SYT-SSX1融合基因能促进滑膜肉瘤sphere的形成。q RT-PCR、Western-Blot和流式细胞仪结果表明:SYT-SSX1型高表达sphere细胞干性比未处理组sphere细胞强,且差异有统计学意义(P0.001)。(2)重组剂TGF-β1处理SYT-SSX1sphere细胞后,发现随着rh TGF-β1浓度升高,SYT-SSX1型高表达sphere细胞数目逐渐增加,单个sphere细胞体积逐渐增大。当rh TGF-β1浓度为10ng/ml,增加最明显,且差异有统计学意义(P0.001)。q RT-PCR、Western-Blot和流式细胞仪结果表明:随着rh TGF-β1浓度升高,SYT-SSX1型高表达sphere细胞干性逐渐增强。当rh TGF-β1浓度为10ng/ml,SYT-SSX1型高表达sphere细胞干性达到最强,且差异有统计学意义(P0.01,P0.001)。(3)抑制剂SB431542处理SYT-SSX1 sphere细胞后,发现随着SB431542浓度升高,SYT-SSX1型高表达sphere细胞数目逐渐减少,单个sphere细胞体积逐渐变小。当SB431542浓度为40 UM时,减少最明显,且差异有统计学意义(P0.01)。q RT-PCR、WesternBlot和流式细胞仪结果表明:随着SB431542浓度升高,SYT-SSX1型高表达sphere细胞干性逐渐减弱。当SB431542浓度为40 UM时,SYT-SSX1型高表达sphere细胞干性达到最弱,且差异有统计学意义(P0.01,P0.001)。结论:1.SYT-SSX1融合基因可能促进滑膜肉瘤sphere细胞的增殖,并且可能增强滑膜肉瘤sphere细胞的干性。2.TGF-β1信号通路可能通过SYT-SSX1融合基因增强滑膜肉瘤干细胞样细胞的干性特征。
【学位单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R738
【部分图文】：

TGF-β1 信号通路调控 SYT-SSX1 诱导滑膜肉瘤干性特征的初步研究结 果（Results） 成功构建 SYT-SSX1 型融合基因高表达 SS 细胞.1 SYT-SSX1 型融合基因慢病毒转染贴壁细胞的形态特征SW982 细胞系（ATCC 库）为 SYT-SSX 融合基因阴性滑膜肉瘤细胞，本采用慢病毒转染方法成功构建 SYT-SSX1 型融合基因高表达细胞， 48h 后染组，瘤细胞呈长梭形，成巢团分布，较为稀疏；转染组瘤细胞变为短梭形边形，细胞核较大，胞质透明，且细胞密度明显比未转染组大，表明 SYT-SS够明显促使瘤细胞生长，如图 1。

2. SYT-SSX1 高表达细胞系。图 A 为 SYT-SSX1 高表达细胞，图 B 为 SYT-SSX1 高表达胞白光（×100），转染效率约 93.86%（0.9386 ± 0.02），图 C 为 SYT-SSX1 高表达细胞的One Step RT-PCR 产物电泳图。PCR 产物为 118bp，SYT-SSX1 融合基因检测为阳性。无血清培养 SW982、SYT-SSX1 型 sphere 细胞比较 SYT-SSX1 融合基因对滑膜肉瘤 sphere 细胞成球数目、体积、成球率的影响无血清悬浮培养 SW982 与 SYT-SSX1 高表达细胞， 24 小时后，两组细胞绝大多数呈单个悬浮生长，无明显差异；48 小时后 SYT-SSX1 高表达细胞可见部分 sphere 形成，SW982 细胞仅见少量的 sphere 形成，单个球体细胞之间排列不紧密，形状不规则，有一定的折光性；72 小时后，SYT-SSX1 高表达细胞可见大量 sphere 形成（图 3B），单个球体细胞之间排列紧密，悬浮生长，球体为圆形或者椭圆形，SW982 细胞可见部分 sphere 形成（图 3A）。成球培养 72 小时后，进行成球数目、体积、成球率比较。实验结果表明：（1成球数目：SYT-SSX1 型高表达细胞比 SW982 细胞成球数目多，SYT-SSX型高表达细胞成球数是 SW982 的 2.5 倍，差异有统计学意义（P<0.001）（图

TGF-β1 信号通路调控 SYT-SSX1 诱导滑膜肉瘤干性特征的初步研究异有统计学意义（P<0.01）（图 3D），（3）成球率：SYT-SSX1 型高表达细胞的成球率比 SW982 细胞高，SYT-SSX1 型细胞成球率是 SW982 的 3.6 倍，差异有统计学意义（P<0.001）（图 3E），如图 3，表 1。
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本文编号：2839962