研究背景修复外伤、疾病及先天畸形等原因导致的大范围软组织缺损常常需要应用组织填充物。目前,诸如真皮移植、人工合成材料及同种异体、异种组织来源填充物填充等多种方法均在临床上采用。而自体脂肪移植因其良好的生物相容性、无免疫源性、获取方便、价格便宜等特性,是理论上最佳的修复方式。然而因临床医生在脂肪组织的采集、处理和移植等方面的操作各不相同,有报道的脂肪移植后的体积吸收率从25%到80%不等,往往需要过度充填或是重复注射2-3次才能达到预期效果,再加上远期可能出现油囊形成、纤维钙化等并发症大大限制了其临床应用。因此,研究者们提出了许多被认为能够提高脂肪移植体积保留率的方法:包括以低压抽吸、离心去水及立体多通道注射为核心的Coleman技术,增加抽吸针口径、低剪切力的采集技术,离心或纱布过滤、洗涤过滤的脂肪处理技术,移植受区微针、预扩张等处理技术,以及添加细胞成分、富血小板血浆(Platclet-rich plasma,PRP)以及各种生物活性因子等方法。通过尽可能地保留完整的脂肪结构,增加组织灌注,促进血管新生等方式,以促进移植物耐受血管重建前极端的缺血缺氧环境,减少组织坏死。然而由于缺乏高质量的临床及临床前数据支持,它们的相对重要性难以评估,目前尚未有一种公认最佳的解决方案能够完全避免移植物的坏死。对脂肪移植后体积保留模式的持续深入研究表明,除了移植物直接存活下来以外,组织再生同样在其中发挥重要作用。研究表明,脂肪组织的正常生理结构主要由两部分组成,即成熟脂肪细胞和位于脂肪细胞间隙内的血管基质片段(Stromal vascular fraction,SVF)。其中成熟脂肪细胞数量仅占不到7%,却占据了组织中900%以上的体积,且具有高耗氧性。在脂肪移植后早期血液循环尚未建立时,仅在移植物的最外层小于300微米的范围内成熟脂肪细胞能够通过组织浸润的方式存活下来,移植物中心大范围成熟脂肪细胞均无法耐受缺血缺氧环境,出现坏死并释放出大量的脂滴,随之机体炎症细胞逐渐浸润移植物,包绕吞噬脂滴及细胞碎片,导致了移植物的体积吸收。最终小型的脂滴被清除,大型脂滴则会被包裹形成油囊、纤维钙化。与此同时,在移植物的外层,SVF细胞群中的脂肪来源干细胞(Adipose-derived stromal cells,ASCs),较脂肪细胞更能够耐受缺血缺氧环境,可以通过分泌成血管相关生长因子,促进新生血管由外向内逐渐长入移植物,同时宿主来源的脂肪前体细胞及少数移植物中残存的基质干细胞随着新生血管的长入逐渐迁入、定植、增殖并最终分化形成新生脂肪细胞,由外而内实现局部的小叶状脂肪再生。由此我们发现:坏死的脂肪细胞是导致脂肪移植后体积保留率下降以及并发症产生的主要原因。那么能否将脂肪移植后的“无效体积”——成熟脂肪细胞在移植之前提前分离去除呢?运用传统的胶原酶消化法、加入异丙醇等液体成分后离心的分离方法势必会引入外源性材料,带来了生物污染的风险,更加难以作为常规临床应用。因此我们创新性地采用了使脂肪抽吸物快速通过较小口径的管道系统的物理方法,利用剪切力选择性破坏体积较大的成熟脂肪细胞,而不损伤体积较小的SVF细胞,继而离心去除原有体积中超过90%的脂滴,在不添加任何外源性物质的前提下,获得了一种新型脂肪产物,我们将其命名为“SVF-gel”。SVF-gel高度浓缩了 ECM保护下的SVF细胞群,平均浓度可达原有水平的4.5倍,其中所含的ASCs更是达到原有的6.3倍,且其成骨、成软骨、成脂分化能力未受损害。研究目的本研究将围绕1、SVF-gel移植后能否长期保留,可否成功诱导体内脂肪新生?2、诱导脂肪新生具体机制为何?3、脂肪新生的组织来源为何?三个问题进行深入讨论。首创性地对一种去除了成熟脂肪细胞的脂肪产物——SVF-gel,移植后组织学的动态变化进行探索,并通过比较SVF-gel与传统脂肪移植在不同时间点的移植效果,观察各时间点移植物体积保留率的变化、加之HE染色、马松染色切片分析,免疫组化等技术来探讨SVF-gel作为组织填充物移植后的效果、组织新生机制及其组织来源,为临床实施高效容量填充提供方法指导及科学依据。材料与方法1、传统游离脂肪及SVF-gel移植的模型制备及移植物存活的评价运用注射器法获取成年健康女性大腿及腹部皮下脂肪,其中一部分运用Coleman技术制备为传统脂肪移植组,另一部分通过以下步骤处理制备为SVF-gel:首先将脂肪抽吸物 1200 g/min 离心 3min 后,弃去底层液体,上层油脂回收备用,将中层脂肪组织装入两枚20ml注射器中,通过鲁尔接头密封对接,反复以10ml/s的速度推动含有脂肪组织的注射器活塞,共推注1min。然后加入回收的油脂缓慢推注3～5次混匀,使用孔径≤0.2mm的Nanotransfer进行过滤后,堵住注射器出口,拉开针栓保持注射器内负压,轻微震荡至注射器中出现絮凝现象。最后2000g/min离心3min,获取中间层产物,即为SVF-g,el。使用1ml注射器连接注脂针,依照随机化原则将两组制备好的移植物分别注射在裸鼠两侧胁肋部皮下的2个受区。分别于注射后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天共9个时间点,观察移植物的大体情况;运用排水法测量移植物体积,计算体积保留率;通过HE染色及马松染色切片评估移植组织状况。2、移植物中脂肪新生和血管新生的检测分别于注射后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天共9个时间点,检测传统脂肪移植组及SVF-gel移植组两组内HE染色、免疫组化染色(分别利用Isolectin、Perilipin抗体和Hoechst染色指示血管、脂肪细胞和有核细胞),通过系统软件分析两组间血管密度、脂肪坏死空泡区域面积及其变化趋势,并进行统计学分析。3、移植物中炎症水平的检测于注射后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天进行免疫组化染色(分别利用MAC2、CD206抗体和Hoechst染色指示巨噬细胞和有核细胞),通过系统软件分析两组间巨噬细胞数量和浸润范围,比较二者炎症水平随时间的变化趋势。4、SVF-gel移植后脂肪新生的组织来源的检测通过对移植后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天共9个时间点的SVF-gel进行免疫组化染色(分别利用HLA抗体、Peril ipin抗体和Hoechst染色指示人来源的移植物细胞,脂肪细胞和有核细胞),观察SVF-gel中人来源的移植物细胞随着时间的变化及转归,评估新生脂肪细胞中移植物组织来源的水平。5、统计学处理数据使用统计学软件SPSS 22.0进行数据处理,数据以平均数±标准差的方式表示。不同时间点的分析使用重复测量资料的方差分析方法,同一时间点两组之间比较使用配对样本t检验方法。(以P0.05认为差异有统计学意义)实验结果1、在移植后1天至15天内,传统脂肪移植组及SVF-gel移植组两组的大体外观及质地相似,均由薄层的具有良好血管化的纤维包膜所包裹。而在移植后15天至90天内,传统脂肪移植组的体积显著下降至原有体积的42%± 9%,表面血管化程度较差,且至后期有肉眼可见的油囊形成。而SVF-gel移植组体积则相对保持稳定在原有体积的82%± 15%,且具有正常脂肪组织外观,两组间有显著差异(P0.05)。2、传统脂肪移植组在移植后3天内仍能保持正常脂肪结构,其后随着时间推移小油囊逐渐形成、增多并融合成片,至15天时组织内部可见大片的坏死油囊区域,并伴有结缔组织的增生和炎症细胞浸润。从30天至90天,尽管在完成血管化的结缔组织内有少量新生的小体积脂肪细胞出现并成熟,但仍有部分大油囊未被完全吸收。而SVF-gel移植后3天内迅速地在组织全层良好血管化的结缔组织中出现大量散在的具有多房脂滴的小体积前脂肪细胞并伴有大量炎症细胞浸润。从15天起,炎症细胞数量逐渐减少,前脂肪细胞逐渐成熟。至90天绝大多数纤维结缔组织被成熟脂肪细胞所替代,仅有少量小油囊形成,相较之下具有更好的组织结构完整性。3、利用马松三色染色观察传统脂肪移植组和SVF-gel移植组中的胶原蛋白,结果提示在移植第30天后,传统脂肪移植组出现了大量的结缔组织,其中可见小体积脂肪细胞新生。而SVF-gel移植组的结缔组织所占据的体积则在不断地减少,逐渐表现为正常脂肪组织结构。对于两组组织纤维化程度的定量分析提示,在移植后30天、60天和90天,传统脂肪移植组的纤维化程度均显著高于SVF-gel移植组。4、分别利用Isolectin、Perilipin抗体指示血管和脂肪细胞,可见传统脂肪移植组移植后1天具有相当多的Perilipin阳性的成熟脂肪细胞,而第3天后这些细胞开始死亡,Perilipin阴性区域逐渐增加,至第15天大部分区域都是Perilipin阴性的坏死区及油囊。相比之下,SVF-gel组第1天时只有少量弱阳性Perilipin表达,但其具有大量Isolectin阳性的血管成分,小体积的新生脂肪细胞在第三天开始出现,逐渐增多并成熟,至移植后15天,新生脂肪连结成片,且伴随着血管新生。5、进一步利用MAC2、CD206抗体指示Ml型巨噬细胞和M2型巨噬细胞对两组炎症模式进行分析,可见在移植后两周内普通脂肪组具有逐步增多的MAC2阳性、CD206阴性的的M1型巨噬细胞浸润。至30天时,这些巨噬细胞转化为MAC2阳性、CD206阳性的的M2型巨噬细胞并围绕着大油滴形成花冠样结构。而SVF-gel移植组则在7天内具有大量的巨噬细胞浸润,包绕着组织内残存的小型油滴,随后炎症细胞数量迅速下降,至30天时仅有少量M2型巨噬细胞存留。6、利用HLA抗体对SVF-gel中移植物来源的细胞进行示踪,可见移植后HLA阳性的区域逐渐减少,在移植后15天,移植物内包含大量体积大小不等,处于不同阶段的脂肪细胞,这些脂肪细胞均为HLA阴性的。仅在脂肪细胞间隙中可以见到HLA阳性的细胞,部分形成血管样结构。因此,SVF-gel中的大量SVF细胞群并未直接分化为成熟脂肪细胞,而是形成了部分新生血管。新生脂肪细胞几乎全部来源于宿主。结论与传统脂肪移植相比,SVF-gel具有更好的长期体积保留率,并且具有独特的脂肪再生模式,即早期大量炎症细胞沿细胞外基质迅速浸润并清除残存油滴,同时组织内出现散在新生脂肪细胞。而后随着新生脂肪逐渐连接成片、新生血管形成,炎症细胞逐渐撤退,最终完成稳定的组织再生。新生组织中成熟脂肪细胞主要源自宿主,部分新生血管源自移植物中的SVF细胞。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R622
【部分图文】：
图１－１?ＳＶＦ＿ｇｅｌ的标准化制备流程??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ?ｏｆ?ＳＶＦ－ｇｅｌ．??②获取的ＳＶＦ－ｇｅｌ与传统Ｃｏｌｅｍａｎ脂肪的对比??制备完成的ＳＶＦ－ｇｅｌ与传统脂肪进行比较，可以发现经过多项纯物理手段??处理的ＳＶＦ－ｇｅｌ仍然具有与脂肪组织类似的外观，其中的成熟脂肪细胞被破坏??后，大量的油滴释放并由离心方法去除，最终体积仅占原有体积的１〇％－１５％。??１０??
?＿??驅權??ｙ｜華??图１?２?ＳＶＦ?ｇｅｌ与传统脂肪大体观察情况??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＶＦ－ｇｅｌ?ａｎｄ?ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ?ｆａｔ．??１．?３．?２移植物大体形态和体积保留率分析??在移植后１天至１５天内，传统脂肪移植组及ＳＶＦ－ｇｅｌ移植组两组的人休外??观及形态质地相似，移植物表面均由薄层的具有良好血管化的纤维包膜所包裹。??而在移植后１５天至３０天内，传统脂肪移植组的体积幵始发生显著下降，表面包??膜血管化程度明显变差，且＾肉眼可见的汕ＩＩ形成。而ＳＶＦ－ｇｅｌ移植组体积则相??对保持稳定，且仍具有饱满的正常脂肪组织外观，表面包膜血管化情况良好。至??移植后９０天，传统脂肪移植组体积仅保持在原有体积的４２％±９％，而ＳＶＦ－ｇｅｌ??１１??
?■??Ｄａｙ?１?Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?５?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１１?Ｄａｙ?１５?Ｄａｙ?３０?Ｄａｙ?６０?Ｄａｙ?９０??图１－３不同时间点移植物的体积保留率。（上图）在移植后１５天到９０天内，传统脂肪移植??组的体积迅速下降，同时可以肉眼可见地观察到油囊形成包膜表面血管密度下降等变化。相??较之下，ＳＶＦ－ｇｅｌ移植组同期保持着更加稳定的体积保留，尽管移植物包膜表面血管密度略??有下降，但在所有时间点中，ＳＶＦ－ｇｅｌ组移植物的性质都是均一而柔软的，无肉眼可见的油??囊形成。（下图）对于两组移植物体积进行定量分析提示，ＳＶＦ－ｇｅｌ组在移植后３０天、６０天??和９０天的体积保留率均明显高于传统脂肪移植组（＊Ｐ＜０．?０５）。图片比例尺＝１厘米。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－３?Ｇｒａｆｔ?ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ?ｒａｔｅｓ?ｏｖｅｒ?ｔｉｍｅ．?（Ｕｐｐｅｒ?ｐａｎｅｌ）?Ｔｈｅ?ｖｏｌｕｍｅｓ?ｏｆ?ｆａｔ?ｇｒａｆｔｓ?ｓｈａｒｐｌｙ?ｄｅｃｒｅａｓｅｄ??ｆｒｏｍ?ｄａｙ?１５?ｔｏ?９０，?ａｓ?ｗｅｌｌ?ａｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｐｏｏｒ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｐｒｅｓｅｎｃｅ?ｏｆ?ｖｉｓｉｂｌｅ?ｏｉｌ??ｃｙｓｔｓ．?Ｂｙ?ｃｏｎｔｒａｓｔ，?ｔｈｅ?ｖｏｌｕｍｅｓ?ｏｆ?ＳＶＦ－ｇｅｌｓ?ｇｒａｆｔ?ｒｅｍａｉｎｅｄ?ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ?ｃｏｎｓｔａｎｔ，?ｗｉｔｈ?ｔｈｅｉｒ?ｔｅｘｔｕｒｅ??ｂｅｉｎｇ?ｓｏｆｔ?ａｔ?ａｌｌ?ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ
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本文编号：
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