极化巨噬细胞与脊髓来源神经干细胞联合移植对脊髓损伤治疗作用的研究

发布时间：2020-10-23 00:59

　　 Ⅰ极化巨噬细胞对胚胎脊髓来源神经干细胞分化及迁移作用的研究脊髓损伤(SCI)后,神经元有限的再生能力以及损伤区不利于神经再生的微环境,使得损伤愈后非常不理想。脊髓损伤后的神经干/前体细胞(NS/PCs)移植,分化而来的神经元替代缺失的神经元,促进神经环路及运动功能恢复,是最具希望的脊髓损伤治疗策略。然而损伤区的微环境却促使绝大多数移植的神经干细胞分化为星形胶质细胞,而无法达到神经元替代治疗的目的。因此为移植的NS/PCs创造适宜的内环境,是达到治疗目的的重要手段。巨噬细胞是参与脊髓损伤后炎症反应的重要免疫细胞,其分泌的多种细胞因子参与损伤微环境的调节。然而巨噬细胞的不同极化状态决定其功能。我们利用骨髓来源的M1/M2型极化巨噬细胞条件性培养基体外培养小鼠胚胎脊髓来源的NS/PCs。M1型条件培养基(M1-CM)促进NS/PCs分化成星形胶质细胞的比例明显高于对照组及M2型条件培养基组;相比之下,M2-CM则促进NS/PCs分化成更多的神经元及少突胶质细胞。将NS/PCs分别与M1或M2巨噬细胞联合移植入正常和损伤的小鼠脊髓后,移植的M1型巨噬细胞可促进NS/PCs向星形胶质细胞方向分化;而M2型巨噬细胞却可以使NS/PCs更多的分化为神经元及少突胶质细胞,分化的神经元可以与宿主神经元细胞发生整合,促进脊髓损伤后运动功能的恢复。此外,极化的巨噬细胞与NS/PCs联合移植入脊髓后,M1型巨噬细胞促进NS/PCs来源的细胞发生远距离迁移,而M2型巨噬细胞则促进NS/PCs来源的细胞聚集在损伤区内,上述两种迁移模式具有趋化因子受体4(CXCR4)依赖性。我们的研究提示:NS/PCs与极化巨噬细胞联合移植可能是脊髓损伤修复有效的治疗策略。Ⅱ脊髓神经干细胞对巨噬细胞极性的影响巨噬/小胶质细胞是CNS免疫应答的主要调节细胞,研究发现移植的NS/PCs具有免疫调节功能,但NS/PCs对脊髓损伤后M1及M2型巨噬细胞的调节作用及机制还不清楚。我们利用AR-/-、PD1-/-两种工具鼠在体内外观察脊髓来源干细胞对M1及M2型巨噬细胞极化状态的影响,以了解外源性移植的神经干细胞对在体免疫反应的调控及调控机制,为CNS损伤的细胞治疗提供理论依据。在体外将胚胎脊髓来源NS/PCs与体外极化培养的M1型巨噬细胞直接接触混合培养发现NS/PCs会降低CD11b+CD86+M1型巨噬细胞比例;当将体外极化的M1、M2型巨噬细胞及NS/PCs三者接触混合培养时,共培养组CD11b+CD86+M1型巨噬细胞比例同样少于对照组。将NS/PCs移植入AR-/-、PD1-/-小鼠SCI模型损伤区后1周,发现NS/PCs移植组脊髓损伤区i NOS+细胞比例明显减少;5周时NS/PCs移植组Arg1+细胞比例多于对照组,结果提示NS/PCs在体内免疫应答起始阶段会减少CD86+i NOS+的M1巨噬细胞的数量,但在损伤后期会使损伤区的Arg1+M2型巨噬细胞聚集,延迟固有免疫应答。体内实验发现移植NS/PCs能使脊髓损伤区Neu N+细胞数增多,并能有效促进运动功能恢复。趋化因子对脊髓损伤后单核细胞的浸润具有重要作用,QRT-PCR检测发现M1型巨噬细胞高表达趋化因子及受体CCR2/MCP-1及CCR5/MIP-1,M1-CM条件培养的NS/PCs低表达CCR2/MCP-1及CCR5/MIP-1,二者是否通过调节趋化因子的表达发挥脊髓损伤后的免疫调节作用以及其他可能的调控机制有待进一步验证。Ⅲ神经干细胞组织特异性差异的研究尽管神经干细胞已用于多种CNS疾病的移植治疗,并取得了一定疗效,但神经干细胞的调控机制如分化、增殖及在病理状况下的调控还不十分清楚。我们体外培养神经干细胞过程中发现,CNS不同组织来源的神经干细胞(海马神经干细胞和脊髓神经干细胞)生长速度及对消化酶的耐受能力不同,因此我们首先验证了两种不同来源神经干细胞增殖速度的差异,并分析其调控机制。细胞粘附分子是调控细胞增殖及分化的重要因素,因此我们检测细胞粘附相关分子在不同来源干细胞及在损伤和正常干细胞中的表达情况,目的是探讨调控神经干细胞组织特异性及脊髓神经干细胞特性的重要调控机制,为脊髓损伤治疗寻找新的出路。结果发现不同时期脊髓来源干细胞Ki67+、Brd U+及PHH3+细胞数少于海马干细胞,结果提示脊髓干细胞增殖速度慢于海马来源干细胞;损伤脊髓干细胞Ki67+及Brd U+细胞数多于正常脊髓干细胞,说明组织损伤可以加快神经干细胞的增殖;免疫荧光染色发现脊髓干细胞细胞粘附相关分子如N-cadherin、β-catenin、Rho A、Pax6表达强于海马干细胞,它们在调控干细胞的粘附、增殖及其他生物学特性中的作用还需要进一步研究。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R651.2
【部分图文】：

Nov;122(11):3824-34.）3 巨噬细胞3.1 巨噬细胞的研究历程（1-图3）1-图3 巨噬细胞生物学研究进程（摘自：J Cell Physiol. 2013 Mar;228(3):502-12.）

Ngn1抑制胶质细胞分化的机制（摘自：Cell.2001Feb9;104(3):365-76.）

bHLH分子对NPC自我更新及细胞命运的调控作用模式图（摘自：Neuron.2014Apr2;82(1):9-23.）

本文编号：2852334