副神经移位膈神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能的中枢机制的研究

发布时间：2020-11-21 02:02

　　 [研究目的]高位颈髓损伤患者,呼吸功能丧失,死亡率极高,为了降低此类患者的死亡率,重建其自主呼吸功能尤为重要。本课题组在国家自然基金的资助下,采用副神经移位膈神经的方法成功重建了高位颈髓损伤大鼠的呼吸功能,建立了动物模型。本研究旨在通过腺相关病毒、伪狂犬病毒逆行示踪及免疫组织化学染色的方法进一步揭示副神经移位膈神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能的中枢机制,为进一步将该方法学运用于临床提供更为殷实的理论依据。[研究方法]本实验以成年雄性SD大鼠为实验动物。利用腺相关病毒AAV-RetroGFP注射副神经、膈神经,进行跨单突触逆行追踪支配正常SD大鼠副神经和膈神经的运动神经元。利用伪狂犬病毒PRV-CMV-EGFP注射副神经、膈神经,进行跨多级突触逆行追踪支配正常SD大鼠副神经和膈神经的前运动神经元及其相关神经核团。利用免疫组织化学染色的方法,对病毒标记核团进行特异性双标,进一步确证病毒标记的神经核团。相同方法,利用腺相关病毒AAV-Retro-GFP、伪狂犬病毒PRV-CMVEGFP注射吻合神经吻合处远端,进行逆行追踪副神经移位膈神经6个月后支配SD大鼠膈肌运动的运动神经元、前运动神经元及其相关神经核团。并利用特异性抗体对病毒标记核团进行双标,进一步确证病毒标记神经核团。最后,通过对比支配正常SD大鼠的膈神经、副神经及神经移位后SD大鼠的吻合神经的运动神经元、前运动神经元及其相关神经核团的变化,初步揭示神经移位重建高位颈髓损伤SD大鼠呼吸功能的中枢机制变化。[结果](1)正常SD大鼠:支配副神经斜方肌支的运动神经元主要集中在延髓网状核。支配副神经的前运动神经元主要集中在孤束核、延髓中缝、面神经核。支配膈神经的运动神经元主要集中在颈髓C4-C6的脊髓前角。支配膈神经的前运动神经元主要集中在腹侧呼吸群、延髓孤束核、延髓中缝、上橄榄核。(2)神经移位后SD大鼠:支配吻合神经的运动神经元主要集中在延髓网状核。支配吻合神经的前运动神经元主要集中在孤束核、延髓中缝、面神经核。[结论]神经移位6个月后,SD大鼠的副神经核和(或)上级神经元发生了重塑,形成了与腹侧呼吸群神经元相同或相似的突触,从而建立了副神经核→副神经→膈神经→膈肌的神经支配通路。最终由副神经核神经元产生节律性电冲动,通过吻合后神经支配膈肌,重建高位颈髓损伤后大鼠的呼吸功能。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.2
【部分图文】：

神经移位膈神经动物模型的制备，选取成年健康雄性 SD 大鼠 46 只，体重 280~300g。0 只，B 组 36 只。A 组为右侧副神经斜方肌支吻合膈神B 组不做处理。A 组按上述神经移位方法学进行手术处法，手术主要过程如图-1（因血液影响图片质量，故图片 图：正常 SD 大鼠副神经解剖。1 标示副神经主干，起乳突肌支，于胸锁乳突肌内侧穿入支配胸锁乳突肌；3 乳突肌（图中 4 标示）内侧向背侧前行，穿入斜方肌，支颈部膈神经起始部解剖。5 标示膈神经主干，由臂丛神经侧膈肌；6 标示臂丛神经主干及其分支。c 图：正常 SD解剖。d 图：副神经斜方肌支与膈神经端-端吻合后解剖神经主干端-端吻合后神经。D 大鼠完全清醒后，送至同济大学动物饲养房，予以充足A、B 两组 SD 大鼠均无死亡。

（一） 正常 SD 大鼠副神经中枢神经通路的研究1、AAV 逆行示踪正常 SD 大鼠副神经运动神经元为了研究副神经第一级运动神经元所处位置，我们利用逆行跨单突触的 AAV 病毒，逆行示踪副神经运动神经元。腺相关病毒 AAV 是良好的跨单突触逆行示踪病毒它具有稳定性、低毒性、基因持久表达性等特性，这些特性使它成为了跨单突触逆行示踪神经元最好的工具病毒之一[25]。取 B 组正常 SD 大鼠 4 只，随机分为甲、乙两组每组两只，甲组为副神经胸锁乳突肌支组，乙组为副神经斜方肌支组。在手术显微镜下，通过显微注射器将 AAV-Retro-GFP 病毒（2.00E+09 PFU/ml；1.5uL/只）分别注入甲、乙两组 SD 大鼠右侧副神经胸锁乳突肌支及副神经斜方肌支，注射方法详见上述实验方法，注射主要过程如图-2 所示（因病毒无色，故注射前，我们往病毒内加入微量无菌染料，利于注射）。可见病毒注射进入神经外膜内，未出现病毒明显外溢现象。待 SD 大鼠完全苏醒后，将其转移入 SPF 级动物房，给予充足食物、饮水。

图-3 SD 大鼠灌流取脑：a 图表示心脏灌流；b 图表示暴露脑组织及颈髓；c 图表示脑组织及颈髓。取出后的脑组织及颈髓进行PFA固定、蔗糖脱水、OTC包埋、冰冻切片等处理，处理方法见前述实验方法。待得到脑组织及颈髓冰冻切片后，对冰冻切片进行免疫组织化学染色处理，免疫组织化学染色方法见前述实验方法，免疫组织化学染色过程中所使用的抗体：I抗—goat anti-GFP （1:2000；NOVUS）；II抗—488 donkey anti-goatlgG（1：500；life technologies）。实验结果显示：AAV-Retro-GFP病毒注射副神经胸锁乳突肌支14天后，AAV-Retro-GFP病毒逆行感染副神经胸锁乳突肌支第一级运动神经元，其冰冻切片显示脑组织中未见病毒示踪，而在颈髓C3到C6脊髓前角中可见AAV病毒示踪，显现绿色荧光，故支配副神经胸锁乳突肌支第一级运动神经元主要位于颈3-颈6脊髓前角，如图-4所示。AAV-Retro- GFP病毒注射副神经斜方肌支14天后，AAV-Retro-GFP病毒逆行感染副神经斜方肌支第一级运动神经元，其冰冻切片显示脑组织的延髓网状核中见病毒示踪，显现绿色荧光，而在颈髓C1到C7脊髓前角中未见AAV病毒示踪，故支配副神经斜方肌支第一级运动神经元位于主要延髓网状核，如图-5所
【参考文献】

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本文编号：2892346