痤疮丙酸杆菌通过NLRP3依赖途径诱导退变髓核细胞焦亡及其机制研究
发布时间：2021-03-24 23:15
椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration,IVD）是引起慢性下腰痛（low back pain,LBP）最重要的原因之一,随着医学的不断发展,人均寿命不断延长,老龄化社会逐渐加剧,IVD的发病率亦呈逐年上升的趋势,造成了严重的家庭和社会经济负担。目前IVD发生的具体机制尚存在争议,因此针对其治疗也尚缺乏有效的手段。近年来研究发现,感染在椎间盘退变的病理过程中发挥着至关重要的作用,且以痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes,P.acnes）的研究最为广泛。但P.acnes对人退变髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPCs）焦亡的影响及其调控机制尚缺乏系统的研究。本课题拟从以下四个方面进行阐述:1、人髓核组织、细胞的提取及痤疮丙酸杆菌感染对髓核细胞炎症因子分泌的影响;2、P.acnes诱导人髓核细胞焦亡的激活;3、MCC950通过TXNIP-NLRP3抑制炎症减轻焦亡;4、MCC950对腰椎间盘内P.acnes感染的影响。第一部分人髓核组织、细胞的提取及痤疮丙酸杆菌感染对髓核细胞炎症因子分泌的影响目的:探讨...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
术中所取髓核组织标本Fig1-1NPSpecimenHarvestDuringOperation
重庆医科大学博士研究生学位论文31（2）NPCs培养约第10-11天后，40倍镜下观察细胞融呈团簇状分布，细胞融合度约50%（图1-2b）；（3）NPCs培养约第14-15天后，镜下(x40)可见细胞呈梭形紧密排列，细胞之间的间隙明显变窄，细胞融合度约为80-90%（图1-2c）。图1-2髓核细胞融合度Fig1-2DegreeofNPCsFusion1.2.5初代髓核细胞传代（1）将培养瓶（T25）内融合度为80-90%的初代NPCs从孵箱内取出，弃瓶内培养基，加入PBS液“∞字法”快速润洗后弃置，重复3次，洗尽残余培养基（以加入培养瓶内清洗后的PBS液清亮、透明为标准）；（2）胰酶消化液取1-2ml加入培养瓶内，75%乙醇喷洒瓶身后放回细胞孵箱内，静置4min；（3）拍打瓶身促进细胞脱落，显微镜下观察细胞是否变圆、漂浮，随后加入等体积完全培养基中和；（4）随后把细胞悬液加入离心管离心（1000r/min，5min），弃上清；（5）加入2ml完全培养基重悬细胞；（6）各培养皿（10cm）中加入1ml细胞重悬液，随后再加入5ml的完全培养基，传代比例为1瓶传2皿；（7）培养皿做好标记，75%乙醇喷洒皿身后孵箱内培养，每3天换液。
重庆医科大学博士研究生学位论文35（6）电泳条件：电压70V，待溴酚蓝指示剂开始进入分离胶后，调整电压值110V，待指示剂接近凝胶底部时停止；（7）打开玻板，取出凝胶块，根据Marker指示，准备相应宽度及长度的PVDF膜，并将PVDF膜放入无水乙醇内活化10min，使其膜带电荷；（8）将凝胶用卡片小心完整的转移至电转夹上，活化后的PVDF膜覆盖在相应位置后，封闭电转夹；（9）凝胶、PVDF膜、电转夹正负极顺序示意图如下（图1-3）：图1-3转膜前安装顺序Fig1-3InstallationSequenceBeforeFilmTransfer（10）电转条件：电转夹正确放置后加入电转液，然后将电转槽放入冰盒，设置电流为250mA，时间110min；（11）取出PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，室温摇床上封闭2小时；（12）PVDF膜在封闭结束后用TBST液润洗一次，放入对应的一抗（IL-1β和IL-18，Abcam，1:1000）孵育盒中，4℃冻库摇床上（70转/min）孵育过夜；（13）将孵育过夜的PVDF膜取出，TBST液洗膜3次，15min/次；（14）将PVDF膜放入相应的二抗，室温摇床上孵育2小时；（15）将PVDF膜再次用TBST液洗3次，15min/次；（16）ECL超敏显影液显影，采集保存图片，ImageJ分析灰度值。
【参考文献】：
期刊论文
[1]The Possibility and Molecular Mechanisms of Cell Pyroptosis After Cerebral Ischemia[J]. Zhaofei Dong,Kuang Pan,Jingrui Pan,Qingxia Peng,Yidong Wang. Neuroscience Bulletin. 2018(06)
本文编号：3098576
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
术中所取髓核组织标本Fig1-1NPSpecimenHarvestDuringOperation
重庆医科大学博士研究生学位论文31（2）NPCs培养约第10-11天后，40倍镜下观察细胞融呈团簇状分布，细胞融合度约50%（图1-2b）；（3）NPCs培养约第14-15天后，镜下(x40)可见细胞呈梭形紧密排列，细胞之间的间隙明显变窄，细胞融合度约为80-90%（图1-2c）。图1-2髓核细胞融合度Fig1-2DegreeofNPCsFusion1.2.5初代髓核细胞传代（1）将培养瓶（T25）内融合度为80-90%的初代NPCs从孵箱内取出，弃瓶内培养基，加入PBS液“∞字法”快速润洗后弃置，重复3次，洗尽残余培养基（以加入培养瓶内清洗后的PBS液清亮、透明为标准）；（2）胰酶消化液取1-2ml加入培养瓶内，75%乙醇喷洒瓶身后放回细胞孵箱内，静置4min；（3）拍打瓶身促进细胞脱落，显微镜下观察细胞是否变圆、漂浮，随后加入等体积完全培养基中和；（4）随后把细胞悬液加入离心管离心（1000r/min，5min），弃上清；（5）加入2ml完全培养基重悬细胞；（6）各培养皿（10cm）中加入1ml细胞重悬液，随后再加入5ml的完全培养基，传代比例为1瓶传2皿；（7）培养皿做好标记，75%乙醇喷洒皿身后孵箱内培养，每3天换液。
重庆医科大学博士研究生学位论文35（6）电泳条件：电压70V，待溴酚蓝指示剂开始进入分离胶后，调整电压值110V，待指示剂接近凝胶底部时停止；（7）打开玻板，取出凝胶块，根据Marker指示，准备相应宽度及长度的PVDF膜，并将PVDF膜放入无水乙醇内活化10min，使其膜带电荷；（8）将凝胶用卡片小心完整的转移至电转夹上，活化后的PVDF膜覆盖在相应位置后，封闭电转夹；（9）凝胶、PVDF膜、电转夹正负极顺序示意图如下（图1-3）：图1-3转膜前安装顺序Fig1-3InstallationSequenceBeforeFilmTransfer（10）电转条件：电转夹正确放置后加入电转液，然后将电转槽放入冰盒，设置电流为250mA，时间110min；（11）取出PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，室温摇床上封闭2小时；（12）PVDF膜在封闭结束后用TBST液润洗一次，放入对应的一抗（IL-1β和IL-18，Abcam，1:1000）孵育盒中，4℃冻库摇床上（70转/min）孵育过夜；（13）将孵育过夜的PVDF膜取出，TBST液洗膜3次，15min/次；（14）将PVDF膜放入相应的二抗，室温摇床上孵育2小时；（15）将PVDF膜再次用TBST液洗3次，15min/次；（16）ECL超敏显影液显影，采集保存图片，ImageJ分析灰度值。
【参考文献】：
期刊论文
[1]The Possibility and Molecular Mechanisms of Cell Pyroptosis After Cerebral Ischemia[J]. Zhaofei Dong,Kuang Pan,Jingrui Pan,Qingxia Peng,Yidong Wang. Neuroscience Bulletin. 2018(06)
本文编号：3098576
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