外泌体及纳米微粒促进牵张成骨骨再生的研究

发布时间：2021-04-27 14:44

　　背景:牵张成骨是一种通过缓慢、持续牵张诱导骨组织再生的外科技术,在治疗四肢大段骨缺损、骨髓炎及骨畸形时具有独特的优势。但该技术治疗周期长,严重影响患者生活质量并可导致并发症发生率升高。加速牵张成骨区新骨再生,缩短患者的治疗周期具有重要临床意义。内皮祖细胞（EPCs）是新生血管形成的重要参与者,EPCs来源的外泌体（EPC-Exos）同样具备刺激血管再生的能力。磁性介孔氧化硅纳米微粒（M-MSNs）是理想的药物运载体,并可能调控间充质干细胞（MSCs）成骨分化。EPC-Exos及M-MSNs促进牵张成骨区新骨再生的作用尚不清楚。目的:评估EPC-Exos及M-MSNs对大鼠胫骨牵张成骨区新骨再生的影响,并探讨其可能机制。方法:分离培养大鼠骨髓来源EPCs,超滤联合超速离心法提取EPC-Exos并通过透射电镜、western blot及TRPS检测进行鉴定,体外实验研究EPC-Exos对内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响和机制;合成M-MSNs并进行表征鉴定,体外实验研究其对MSCs存活、增殖和成骨分化的影响及机制;构建大鼠胫骨牵张成骨模型,借助X线、micro-CT、Microfil灌注... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：94 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 绪论
第二章 EPC-Exos促进牵张成骨区骨再生的研究
    2.1 前言
    2.2 材料及方法
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 主要耗材、仪器
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 主要试剂配制
        2.2.5 细胞培养
            2.2.5.1 EPCs分离培养
            2.2.5.2 EPCs鉴定
            2.2.5.3 HUVECs培养
        2.2.6 EPC-Exos的提取
        2.2.7 EPC-Exos的鉴定
            2.2.7.1 EPC-Exos形态学鉴定
            2.2.7.2 EPC-Exos粒径分布测定
            2.2.7.3 EPC-Exos表面标志物鉴定
        2.2.8 体外实验
            2.2.8.1 细胞增殖实验
            2.2.8.2 细胞划痕迁移实验
            2.2.8.3 细胞体外成管实验
            2.2.8.4 Western blot分析
            2.2.8.5 qRT-PCR实验
            2.2.8.6 ELISA检测
        2.2.9 动物实验
            2.2.9.1 构建大鼠牵张成骨模型
            2.2.9.2 活体成像实验
            2.2.9.3 X线摄片
            2.2.9.4 Micro-CT检测
            2.2.9.5 生物力学测试
            2.2.9.6 Microfil灌注扫描
            2.2.9.7 组织学检测
            2.2.9.8 免疫组织化学检测
        2.2.10 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 EPCs分离培养及鉴定
        2.3.2 EPC-Exos鉴定
            2.3.2.1 透射电镜
            2.3.2.2 q NANO粒径分析
            2.3.2.3 外泌体标志物分析
            2.3.2.4 外泌体mi R-126 水平
        2.3.3 EPC-Exos促进延长区新骨再生
            2.3.3.1 建立大鼠胫骨牵张成骨模型
            2.3.3.2 外泌体活体成像
            2.3.3.3 X线片
            2.3.3.4 micro-CT扫描
            2.3.3.5 生物力学检测
            2.3.3.6 HE及Masson三色染色结果
            2.3.3.7 血管灌注扫描
            2.3.3.8 免疫组化染色结果
        2.3.4 EPC-Exos增强HUVECs生物学功能
            2.3.4.1 EPC-Exos促进HUVECs增殖
            2.3.4.2 EPC-Exos提高HUVECs迁移能力
            2.3.4.3 EPC-Exos增加HUVECs成管能力
            2.3.4.4 EPC-Exos激活RAF/ERK信号通路
            2.3.4.5 EPC-Exos增加HUVECs血管形成相关基因的转录表达水平
    2.4 讨论
    2.5 结论
第三章 M-MSNs促进牵张成骨区骨再生的研究
    3.1 前言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 实验动物
        3.2.2 主要耗材、仪器
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 主要试剂配制
        3.2.5 M-MSNs合成鉴定
        3.2.6 细胞培养
        3.2.7 体外实验
            3.2.7.1 普鲁士蓝染色
            3.2.7.2 Live/Dead活死细胞染色实验
            3.2.7.3 CCK-8 细胞增殖实验
            3.2.7.4 MSCs成骨分化诱导
            3.2.7.5 ALP活性测定
            3.2.7.6 ALP染色
            3.2.7.7 ARS染色检测钙盐沉积
            3.2.7.8 q RT-PCR检测成骨相关基因及Wnt通路相关分子转录水平
            3.2.7.9 Western blot分析检测GSK-3β 及 β-catenin水平
        3.2.8 动物实验
            3.2.8.1 大骨胫骨牵张成骨模型
            3.2.8.2 延长胫骨X线摄片
            3.2.8.3 延长胫骨micro-CT扫描
            3.2.8.4 生物力学检测
            3.2.8.5 延长胫骨组织学检测
            3.2.8.6 延长胫骨免疫组织化学检测OCN、Col-1 及 β-catenin
        3.2.9 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 M-MSNs表征
        3.3.2 MSCs剂量依赖性摄取M-MSNs
        3.3.3 M-MSNs具有良好的生物相容性
            3.3.3.1 活死细胞染色
            3.3.3.2 细胞增殖实验
        3.3.4 M-MSNs增强MSCs成骨分化
            3.3.4.1 ALP活性测定
            3.3.4.2 ALP染色结果
            3.3.4.3 ARS染色结果
            3.3.4.4 q RT-PCR检测成骨基因转录水平
        3.3.5 M-MSNs激活Wnt信号通路
        3.3.6 动物实验
            3.3.6.1 建立大鼠胫骨牵张成骨模型
            3.3.6.2 M-MSNs促进延长区骨痂形成
            3.3.6.3 延长区新生骨组织Micro-CT分析
            3.3.6.4 M-MSNs提高延长区生物力学参数
            3.3.6.5 组织学检测结果
            3.3.6.6 免疫组织化学染色结果
    3.4 讨论
    3.5 结论
第四章 全文总结及展望
参考文献
致谢
博士在读期间发表论文和科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]牵引成骨术与骨生长因子[J]. 徐袁瑾,张志愿,沈国芳.  上海口腔医学. 2002(02)



本文编号：3163651