lncRNA XLOC-005950/miR-362-5p/SATB2网络调控对骨肉瘤细胞生物学性状的影响

发布时间：2021-04-29 14:00

　　研究背景骨肉瘤是一种最常见的原发性骨恶性肿瘤,儿童和青少年的发病率较高,早期侵袭性转移会使骨肉瘤快速进展以及引起不良的预后,从而导致整体存活率较低。近年来,靶向治疗在骨肉瘤的治疗中显示出巨大的潜力,但仍需探索更有效的治疗靶标。长非编码核糖核酸（lncRNA）在癌症生物学中起着重要的作用,可以作为调节肿瘤转移的关键调节因子,也可以与miRNA作用直接或间接地调节目的蛋白的表达。然而,lncRNA在骨肉瘤中的作用仍需更多的探索和研究。特异AT序列结合蛋白2（SATB2）是一种DNA结合蛋白,可以特异性结合核基质附着区,并作为染色质高级结构域转录的调节剂,且与多种恶性肿瘤中与侵袭、转移和凋亡等过程相关。我们前期实验研究初步表明lncRNA-miRNA-mRNA网络调控与骨肉瘤之间存在着潜在联系,这为探讨骨肉瘤发生发展的分子机制提供了新的思路。本课题组拟对lncRNA XLOC-005950与miR-362-5p的靶向作用及miR-362-5p与靶基因SATB2的靶向作用对骨肉瘤侵袭、迁移和凋亡的调控及生物学性状的影响作进一步研究。研究目的本研究通过生物信息学软件预测lncRNA XLOC-0... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
中英文缩略表
1 引言
2 材料
    2.1 组织来源
    2.2 细胞系与菌株来源
    2.3 质粒
    2.4 引物
    2.5 主要实验试剂
    2.6 主要实验仪器
    2.7 常用溶液配制
        2.7.1 磷酸缓冲盐溶液（PBS）
        2.7.2 胰蛋白酶的配置（0.25 %）
        2.7.3 DMEM细胞完全培养基的配置
        2.7.4 考马斯亮蓝染色液的配置（0.25%）
        2.7.5 考马斯亮蓝脱色液的配置
        2.7.6 电泳缓冲液的配置（5×）
        2.7.7 转膜缓冲液的配置（5×）
        2.7.8 TBST缓冲液的配置
        2.7.9 封闭液的配置
        2.7.10 稀释miR-362 mimics与NC
        2.7.11 LB液体培养基的配置
        2.7.12 LB固体培养基的配置
3 实验方法
    3.1 细胞培养
        3.1.1 细胞复苏
        3.1.2 细胞传代
        3.1.3 细胞冻存
    3.2 RT-qPCR检测骨肉瘤组织及其癌旁组织中lncRNA XLOC-005950、SATB2 mRNA和miR3625P的表达水平
        3.2.1 骨肉瘤组织及其癌旁组织中总RNA的提取
        3.2.2 合成cDNA
        3.2.3 qPCR反应
    3.3 RT-qPCR检测细胞中lncRNA XLOC-005950、SATB2 mRNA、VEGF-B和miR3625P的表达水平
        3.3.1 细胞中总RNA的提取
        3.3.2 合成cDNA
        3.3.3 细胞的qPCR反应
    3.4 Western Blot检测骨肉瘤组织及其癌旁组织中SATB2的表达水平
        3.4.1 提取组织中总蛋白
        3.4.2 SDS-PAGE胶
        3.4.3 Western Blot实验
    3.5 Western Blot检测细胞中目的蛋白的表达水平
        3.5.1 提取细胞中总蛋白
        3.5.2 SDS-PAGE胶
        3.5.3 Western Blot实验
    3.6 细胞转染及转染效率检测
        3.6.1 细胞的转染
        3.6.2 转染效率的检测
    3.7 CCK-8 实验检测细胞增殖
    3.8 Transwell实验检测细胞侵袭
    3.9 划痕实验检测细胞迁移
    3.10 流式细胞术Annexin V/PI双染检测细胞凋亡
    3.11 生物信息学预测靶基因
    3.12 双荧光素酶报告实验验证匹配结合作用
        3.12.1 基因组DNA的提取
        3.12.2 野生型及突变型载体构建
        3.12.3 双荧光素酶报告实验
    3.13 统计学分析
4 实验结果
    4.1 骨肉瘤组织及其癌旁组织中lncRNA XLOC-005950、SATB2及miR3625p的表达水平
    4.2 骨肉瘤细胞系MG63、敲除细胞系MG63~(-/-)和正常人成骨细胞系h FOB1.19中lncRNA XLOC-005950、SATB2及miR3625p的表达水平
    4.3 CCK-8 检测骨肉瘤细胞系MG63、敲除细胞系MG63~(-/-)和正常人成骨细胞系h FOB1.19 的增殖能力
    4.4 Transwell实验检测骨肉瘤细胞系MG63、敲除细胞系MG63~(-/-)和正常人成骨细胞系h FOB1.19 的侵袭能力
    4.5 划痕实验检测骨肉瘤细胞系MG63、敲除细胞系MG63~(-/-)和正常人成骨细胞系h FOB1.19 的迁移能力
    4.6 流式细胞术Annexin V/PI双染实验检测骨肉瘤细胞系MG63、敲除细胞系MG63~(-/-)和正常人成骨细胞系h FOB1.19 的细胞凋亡
    4.7 验证骨肉瘤细胞MG63转染miR3625p mimics的效果
    4.8 CCK-8 检测骨肉瘤细胞系MG63转染miR3625p mimics后的增殖能力31
    4.9 Transwell实验检测骨肉瘤细胞系MG63转染miR3625p后的侵袭能力32
    4.10 划痕实验检测骨肉瘤细胞系MG63转染miR3625p mimics后的迁移能力
    4.11 流式细胞术Annexin V/PI双染实验检测骨肉瘤细胞系MG63转染miR3625p后的细胞凋亡
    4.12 骨肉瘤细胞MG63转染miR3625p mimics后SATB2的表达
    4.13 生物信息学预测
    4.14 双荧光素酶报告实验验证lncRNA XLOC-005950、miR3625p和SATB2的匹配作用
        4.14.1 重组载体的测序结果
        4.14.2 双荧光素酶报告实验结果
5 讨论
6 结论
7 参考文献
综述
    参考文献
个人简历
致谢



本文编号：3167659