退变椎间盘酸性环境下GPR4介导cAMP蓄积调控髓核退变的作用及机制研究

发布时间：2021-05-22 00:04

　　椎间盘退变性疾病（Degenerative disc disease,DDD）临床极其常见,是引起颈肩腰腿疼痛的主要原因之一。资料显示,我国DDD患病率逐年上升,已成为严重影响大众健康和生活质量的主要疾病之一。目前DDD的治疗方法主要包括药物对症和手术治疗等,但这些治疗均未能针对椎间盘退变的病理生理过程,远期疗效不令人满意。近年来,细胞移植和基因治疗等生物学方法逐渐成为DDD治疗的研究热点,并有望在退变早期有效阻止或逆转椎间盘退变过程。目前已经发现,椎间盘退变始发于髓核,最主要病理特征是髓核细胞总数量减少、细胞外基质合成代谢与分解代谢失平衡,具体表现为椎间盘内髓核细胞凋亡减少,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖等细胞外基质合成减少、降解增多,而炎症反应在此过程中起着关键性作用。针对此病理特征,学者们尝试通过细胞移植和生长因子注射等生物学方法修复退变的髓核。然而,研究结果表明,现有的生物学方法依然未能阻止或逆转椎间盘退变过程,修复效果远未达到预期目标,距离临床应用尚有很大的距离。椎间盘是人体最大无血管组织,局部为一特异性酸性环境。最新研究发现,退变椎间盘酸性环境也是导致髓核退变的关键因素之一。因椎间... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

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绪论
    1. 椎间盘退变的治疗现状
    2. 髓核退变的生物学治疗
    3. 椎间盘特有酸性微环境与髓核退变的关系
    4. GPR4与炎症相关信号通路的联系
    参考文献
第一章 体外退变椎间盘酸性环境下GPR4调控髓核退变的作用研究
    1.1 引言
    1.2 实验试剂与仪器
        1.2.1 试剂与耗材
        1.2.2 实验仪器、材料与器械
        1.2.3 相关溶液的配置
    1.3 实验方法
        1.3.1 髓核细胞分离培养
        1.3.2 细胞冻存
        1.3.3 细胞复苏
        1.3.4 髓核细胞的番红O、甲苯胺蓝和阿利新蓝染色
        1.3.5 模拟椎间盘微环境的酸性培养液的制备
        1.3.6 实时定量PCR检测
        1.3.7 Western Blot
        1.3.8 基因转染和RNA干扰(RNA interference,RNAi)
        1.3.9 CCK-8检测细胞增殖
        1.3.10 细胞免疫荧光
        1.3.11 细胞免疫组化
        1.3.12 统计分析
    1.4 实验结果
        1.4.1 髓核细胞的分离培养及染色
        1.4.2 退变椎间盘酸性环境下髓核细胞高表达GPR4
        1.4.3 髓核细胞GPR4的过表达(overexpression)和敲除(knockdown)
        1.4.4 退变椎间盘酸性环境下GPR4表达变化与炎症介质、细胞外基质降解酶的表达水平的关联
        1.4.5 退变椎间盘酸性环境下GPR4表达变化与聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达水平的关联
        1.4.6 严重退变椎间盘酸性环境下过表达与敲除GPR4后阿利新蓝染色
    1.5 讨论
    1.6 结论
    参考文献
第二章 GPR4介导cAMP蓄积调控髓核退变的具体分子机制研究
    2.1 引言
    2.2 实验试剂与仪器
        2.2.1 试剂与耗材
        2.2.2 实验仪器、材料与器械
        2.2.3 相关溶液的配置
    2.3 实验方法
        2.3.1 EIA法检测髓核细胞内cAMP的蓄积水平
        2.3.2 ELISA法检测培养液IL-1β、iNOS、TNF-α、MMP-3,13和ADAMTS-5
        2.3.3 Western Blot
        2.3.4 统计分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 退变椎间盘酸性微环境下髓核细胞cAMP的蓄积水平
        2.4.2 GPR4参与调控髓核细胞在退变椎间盘酸性环境下JNK和p38 MAPK的磷酸化水平
        2.4.3 信号分子cAMP和PKA参与GPR4调控JNK和p38 MAPK的磷酸化水平的作用
        2.4.4 退变椎间盘酸性微环境下JNK和p38 MAPK信号通路对炎症介质与细胞外基质降解酶的调控
    2.5 讨论
    2.6 结论
    参考文献
第三章 体内水平GPR4调控髓核退变的具体作用研究
    3.1 引言
    3.2 实验试剂与仪器
        3.2.1 试剂与耗材
        3.2.2 实验仪器、材料与器械
        3.2.3 相关溶液的配置
    3.3 实验方法
        3.3.1 实验动物的分组
        3.3.2 建立椎间盘退变动物模型与药物注射
        3.3.3 Real-time PCR检测
        3.3.4 钼靶X线检查及椎间盘高度指数(disc heightindex,DHI)计算
        3.3.5 磁共振检查
        3.3.6 组织学染色
        3.3.7 统计学分析
    3.4 实验结果
        3.4.1 GPR4的敲除水平
        3.4.2 椎间盘X线检查结果
        3.4.3 椎间盘MRI检查结果
        3.4.4 椎间盘组织学染色结果
    3.5 讨论
    3.6 结论
    参考文献
综述
    参考文献
作者简历及在学期间所取得的科研成果



本文编号：3200605