细胞骨架蛋白介导Hippo信号调控对椎间盘髓核细胞形态及增殖活性的效应机制研究

发布时间：2021-06-20 12:48

　　第一部分Hippo信号通路介导椎间盘退变及髓核细胞老化目的探讨Hippo信号通路介导椎间盘退变及髓核细胞老化的机制研究方法选取10周龄SD大鼠作为加速椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）模型对象,使用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3ml/100g）,定位尾椎椎间盘5-6,6-7,7-8,8-9共4个椎间盘,选用21G穿刺针,进行加速IDD造模。术后4周（P4w组）和术后12周（P12w组）进行影像学观察。同时选取椎间盘自然退变组SD大鼠,分别是4周龄（4w组）、14周龄（14w组）、22周龄（22w组）、50周龄（50w组）,14w组和22w组分别是P4w组和P12w组的自然对照组。影像学（X射线和磁共振）和病理学检测椎间盘退变,髓核组织基因和蛋白定量检测Hippo信号通路关键分子。选取第三代髓核细胞（Nucleus pulposus cells,NPCs）（P3）进行复制性老化诱导,通过连续复制传代（1:3传代）培养,一般传至第10代（P10）即可出现老化表型。通过细胞形态观察、生长曲线测定、细胞衰老β-半乳糖苷酶（Senescence... 

【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【部分图文】：

自然衰老组椎间盘退变（IDD）随年龄增长逐渐发生

第一部分Hippo信号通路介导椎间盘退变及髓核细胞老化35的软骨细胞样细胞簇状排列，我们可以看到AF和NP边界断裂，以及AF中纤维环排列紊乱，纤维环之间出现裂隙和断裂（图4G）。图2：椎间盘自然退变与纤维环穿刺诱导退变HE病理学观察（下一排是局部放大效果，黑色箭头代表脊索样髓核细胞）。2.4纤维环穿刺诱导椎间盘退变发生不完全自我修复为探讨自然椎间盘退变组与穿刺组Hippo信号的差异，选取术后4w大鼠作为研究对象。令人惊讶的是，YAP在椎间盘的所有区域（NP，AF和CE）都上调，换句话说，Hippo信号通路被抑制（图3A）。NP中的RealtimePCR和Westernblot也表明Hippo信号被抑制，YAP的表达增加，而p-YAP的表达减少（图3B-C）。提取NP的全基因RealtimePCR和全蛋白Westernblot检测目的基因YAP和和下游靶基因CTGF。显示年龄越小，YAP和CTGF基因及蛋白的表达越高。在P4w组，YAP基因的表达与CTGF的表达趋势一致，然而CTGF基因的表达与蛋白质的表达趋势不一致，我们推测椎间盘存在一定的自我修复能力和不完全自我修复（转录后调节）（图3D和E）。为了研究纤维环穿刺损伤时间对YAP表达的影响，我们将观察时间延长到穿刺后12w，并选择22w大鼠作为对照。在本研究中，在P12w组，我们发现YAP在椎间盘中的表达下降（NP,AF和CE）（图4G）。YAP和CTGF在基因和蛋白质水平上是一致的且都下降（图4H和J）。我们发现急性IDD时发现YAP表达增高，说明纤维环机械损伤条件下椎间盘自身具有一定的自我修复能力，而在慢性IDD中YAP被抑制。

东南大学博士学位论文36图3：椎间盘自然退变组逐渐发生IDD，急性纤维环穿刺组快速诱导IDD并存在不完全自我修复代偿。（A）定量聚合酶链反应（RealtimePCR）比较4w、14w、P4w和50w组Hippo信号通路关键分子LATS1、LATS2、YAP和CTGF的相对表达；（B-E）蛋白质印迹分析Hippo信号通路关键分子LATS1、LATS2、YAP、p-YAP和CTGF蛋白表达。柱状图显示目的蛋白平均值相对内参GAPDH表达量（C和E）（*P<0.05）。


本文编号：3239223