Smad7蛋白对瘢痕疙瘩角质形成细胞的影响研究

发布时间：2021-09-25 04:17

　　[目的]既往对瘢痕疙瘩发病机制的研究,主要致力于成纤维细胞、细胞外基质等,现越来越多的证据证明角质形成细胞也积极参与瘢痕疙瘩的发生发展,而其在瘢痕疙瘩病理过程中的作用有待深入探索。本研究构建高表达Smad7的瘢痕疙瘩角质形成细胞（Keloidkeratinocyte,KK）,检测KK的功能变化情况,探索Smad7蛋白以及KK与瘢痕疙瘩形成的上皮-间质转化和TGF-β信号通路之间的关系,为研发瘢痕疙瘩对应治疗的新策略和新方法提供科学依据。[方法]取一名男性患者肩胛部瘢痕疙瘩（经患者同意）,手术切除的组织作为实验标本来源,在无菌条件下采用细胞培养法体外培养KK。体外构建高表达Smad7的慢病毒,并以对应空载体制作慢病毒。使用感染增强剂Polybrene构建细胞株,并按照细胞株分组为:KK组（正常分离培养的瘢痕疙瘩角质形成细胞）、GFP组（空载体慢病毒感染组）和mSmad7组（高表达Smad7慢病毒感染组）,通过QPCR定量检测Smad7 mRNA表达水平和Western Blotting检测Smad7蛋白表达水平评估感染效率。以高效感染和表达Smad7为基础:流式细胞仪检测周期变化情况,C... 

【文章来源】：昆明医科大学云南省

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１分离细胞的瘢痕疙瘩组织图??

，转移置含ＰＢＳ的??１５ｍｌ离心管中，８００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ??②弃上清，加入新鲜的培养基吹打混匀后转移置细胞培养瓶中??③置于细胞培养箱中培养??２．２?Ｓｍａｄ７基因过表达载体构建和慢病毒包装??２．２．１?Ｓｍａｄ７表达载体构建??（１）酶切位点分析：通过美国国家生物技术信息中心（ｈｔｔＰｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．??ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）查询到基因号为ＮＭ—００５９０４．３的序列，序列通过ｐｒｉｍｅｒ?ｐｒｉｍｅｒ５??软件和结合ｐＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ载体（如图２）酶切位点选择ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ。??ＰＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ?Ｃａｔ．?Ｎｏ．?ＶＬ３４０１??５＿?ＬＴＲ??Ａｍｐ（Ｒ）?【?７、，，Ｐｓｉ??／ＲＲＥ??ｐＵＣ．?ｏｒｉｇｉｎ?￡■／??置?ｃＰＰＴ／ＣＴＳ??ｐＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ?＾??８９０４?ｂｐ??ＣＭＶ?Ｐｒｏｍｏｔｅ??？ＬＴＲ＾＼，?Ｍ??＼／?ＥＧＦＰ??Ｖ－ｆＲｔ?…．?ＭＣ５??Ｐｏｒｏ（Ｒ）／?ＰＧＫ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ??图２?ｐＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ载体结构??１３??

装成每支８０ｕｌ，取其中的一支加入１５ｘ蛋白上样缓冲液２（Ｖ丨，于沸水浴中煮５ｍｉｎ，??－８０°Ｃ保存。??（２）用ＢＣＡ蛋白定量试剂盒测定样品中蛋白含量：按照碧云天提供的试剂??盒提供酶标仪测定样品在５６２ｎｍ处的吸光值将ＢＳＡ标准品在５６２ｎｍ处经过空白??校正的平均吸光值对其浓度（Ｈｇ／ｍＬ）作图，绘制标准曲线，如图３。ｙ＝２．１５２＊Ｘ??＋０．１９５９，Ｙ：吸光值，Ｘ：浓度（呢／ｍＬ）；?Ｒ２＝０．９９７。根据标准曲线计算出样??品的蛋白浓度（图３）。??１．５－１??Ｙ?＝?２．１５２＊Ｘ?＋０．１９５９?＆??Ｒ２＝０．９９７?＾??｜?１０??！?０?５??１?＞??０．０－１?１?１?１??０．０?０．２?０．４?０．６??ＢＳＡ?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｕｇ／ｕｉ）??图３蛋白浓度测定标准曲线??（３）制胶：根据下面表格按顺序制备分离胶和浓缩胶，先制备分离胶，并用异??丙醇液封闭，３０ｍｉｎ后弃去异丙醇，用蒸馏水洗１０次，用纸吸干水。浓缩胶配??好后ｌＯｍｉｎ即可开始使用。??分离胶制备如下表９：??１０％胶（１０ｍｌ）蒸馏水?３０％Ａｃｒ－Ｂｉｓ?ｌＭＴｒｉｓ?１０％Ｓ?１０％?过硫酸?ＴＥＭ??（２９：１）?ＰＨ８．８?ＤＳ?铵?ＥＤ??体积（ｍｌ）?２．７?３．３?３．８?０．１?０．１?０．００４??２０??


本文编号：3409072