重组慢病毒介导恒河猴反义miR-155在恒河猴未成熟树突状细胞中的表达和鉴定
发布时间：2021-11-18 07:55
[目的]构建恒河猴反义miR-155（Micro RNA-155,微小RNA-155）慢病毒载体并鉴定,诱导并培养恒河猴未成熟的树突状细胞,用重组的反义miR-155慢病毒载体转染恒河猴未成熟树突状细胞,PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）检测miR-155在恒河猴未成熟树突状细胞中的表达。[方法]1.将慢病毒载体酶切,与目的基因的退火双链DNA连接,其产物加入感受态细胞中培养。将培养出的载体进行测序。包装慢病毒载体,经浓缩纯化后,使用药筛法测定病毒滴度。2.使用恒河猴外周血,通过加入细胞因子GM-CSF（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）（1 OOng/ml）、IL-4（Interleukin-4,白细胞介素-4）（50ng/ml）体外诱导并培养恒河猴未成熟的树突状细胞,通过流式细胞仪及扫描电镜进行免疫表型鉴定及超微结构观察。3.用重组慢病毒载体转染恒河猴的未成熟树突状细胞,RT-qPCR（Real-time Quantitative Polymera...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．ＧＶ２８０载体图谱??
ＨＥＫ－２９３细胞完全培养基］ｍｌ，吹匀后使得细胞可以悬浮，随后将其放入含有二??氧化碳浓度为二十分之一，温度３７°Ｃ的培养箱中，培养一天后更换ＨＥＫ－２９３细??胞完全培养基，随后继续进行培养。??ＨＥＫ－２９３细胞的传代??ＨＥＫ－２９３细胞汇合度到达十分之八到十分之九间进行传代。??抛弃ＨＥＫ－２９３细胞完全培养基，随后在６孔板上滴入５ｍｌ灭菌ＰＢＳ液体洗??涤细胞生长面，随后丢弃该液体。??加入浓度为０．２５％的胰蛋白酶消化液ｌｍｌ，随后轻晃６０秒到１２０秒，使得??细胞脱落下来，随后再加入５ｍｌ?ＨＥＫ－２９３细胞完全培养基，并用刻度吸管吹打??几次，可以使得瓶壁的细胞得到完全冲洗。??２．２．２质粒转染与慢病毒载体收获??Ｑｉａｇｅｎ公司的质粒抽提试剂盒中提取到的慢病毒质粒ＤＮＡ有三种，为了测??试其纯度，将其置于溶于除菌的ＴＥ缓冲液中，用紫外光吸收法测量，得出所提??取的质粒?ＤＮＡＡ２６０／Ａ２８０?介于?１．８－２．０。??病毒包装辅助质粒ｐＨｅｌｐｅｒ?１．０载体图谱：??ｋ?＾＼Ｐ〇??占厂Ｉ?Ｈｅｌｐｅｒｌ?．０?１?＼??ＫＪ??ａｕＢ?ＲＲＥ??图２．?ｐＨｅｌｐｅｒｌ．Ｏ辅助质粒载体图谱??１８??
病毒包装辅助质粒ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０载体图谱：??〇／?Ｈｅｌｐｅｒ２．０?＼??ｉ?５．８?ｋｂ?！??Ｗ??图３．?ｐＨｅｌｐｅｒ２．０辅助质粒载体图谱??在转染开始前２４小时，用含有十分之一胎牛血清的培养基将细胞密度调整??为ｘｌＯ６细胞／１５ｍｌ，与此同时，用胰蛋白酶对对数生长期的ＨＥＫ－２９３细胞进行??消化，其后，将其重新接种在１０ｃｍ细胞培养皿，最后将其放置于温度为３７°Ｃ’??二氧化碳浓度为二十分之一的培养箱内，待整一天后细胞密度处于７０％到８０％??的区间可进行转染。??转染前２ｈ更换为无血清培养基。??为了形成转染混合液，向灭菌离心管内加入ＧＶ２８０载体质粒２０吨、ＰＨｅｌＰｅｒ??１．０载体质粒１５呢、ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０载体质粒丨〇ｆｉｇ的ＤＮＡ溶液，并将其与??Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００转染试剂混合，使得体积为１ｍｌ，在常温下培育１５分钟可??得。??在温度为３７°Ｃ，二氧化碳浓度为二十分之一环境下，将ＤＮＡ和??Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００混合液置于ＨＥＫ－２９３细胞的培养液中培育。??经过６小时的培养丢弃含有混合液的培养基，并加入ＰＢＳ液ｌ〇ｍｌ进行清洗，??轻晃器皿以洗净残余混合液。??在温度为３７°Ｃ，二氧化碳浓度为二十分之一温箱中加入含有十分之一的胎??牛血清的细胞培养基２０ｍｌ，，培养４８ｈ。??１９??
【参考文献】：
期刊论文
[1]B cells with regulatory properties in transplantation tolerance[J]. Justine Durand,Elise Chiffoleau. World Journal of Transplantation. 2015(04)
[2]肝移植术后中长期管理应注意的问题[J]. 窦科峰,张毅. 临床外科杂志. 2009 (09)
[3]当前肝移植外科应注意的问题[J]. 夏穗生. 中华肝胆外科杂志. 2003(05)
本文编号：3502511
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．ＧＶ２８０载体图谱??
ＨＥＫ－２９３细胞完全培养基］ｍｌ，吹匀后使得细胞可以悬浮，随后将其放入含有二??氧化碳浓度为二十分之一，温度３７°Ｃ的培养箱中，培养一天后更换ＨＥＫ－２９３细??胞完全培养基，随后继续进行培养。??ＨＥＫ－２９３细胞的传代??ＨＥＫ－２９３细胞汇合度到达十分之八到十分之九间进行传代。??抛弃ＨＥＫ－２９３细胞完全培养基，随后在６孔板上滴入５ｍｌ灭菌ＰＢＳ液体洗??涤细胞生长面，随后丢弃该液体。??加入浓度为０．２５％的胰蛋白酶消化液ｌｍｌ，随后轻晃６０秒到１２０秒，使得??细胞脱落下来，随后再加入５ｍｌ?ＨＥＫ－２９３细胞完全培养基，并用刻度吸管吹打??几次，可以使得瓶壁的细胞得到完全冲洗。??２．２．２质粒转染与慢病毒载体收获??Ｑｉａｇｅｎ公司的质粒抽提试剂盒中提取到的慢病毒质粒ＤＮＡ有三种，为了测??试其纯度，将其置于溶于除菌的ＴＥ缓冲液中，用紫外光吸收法测量，得出所提??取的质粒?ＤＮＡＡ２６０／Ａ２８０?介于?１．８－２．０。??病毒包装辅助质粒ｐＨｅｌｐｅｒ?１．０载体图谱：??ｋ?＾＼Ｐ〇??占厂Ｉ?Ｈｅｌｐｅｒｌ?．０?１?＼??ＫＪ??ａｕＢ?ＲＲＥ??图２．?ｐＨｅｌｐｅｒｌ．Ｏ辅助质粒载体图谱??１８??
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【参考文献】：
期刊论文
[1]B cells with regulatory properties in transplantation tolerance[J]. Justine Durand,Elise Chiffoleau. World Journal of Transplantation. 2015(04)
[2]肝移植术后中长期管理应注意的问题[J]. 窦科峰,张毅. 临床外科杂志. 2009 (09)
[3]当前肝移植外科应注意的问题[J]. 夏穗生. 中华肝胆外科杂志. 2003(05)
本文编号：3502511
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