晚期糖基化终产物介导的钙稳态失衡在椎间盘退变中的作用及机制研究

发布时间：2021-11-24 22:06

　　目的:前期实验证实晚期糖基化终产物（AGE）随年龄增加在椎间盘内累积是椎间盘退变的重要危险因素,其可以促进髓核细胞凋亡,加速细胞外基质代谢失衡。但其中确切分子机制尚未完全明确,本实验旨在进一步探究AGEs与内质网应激、凋亡、钙稳态之间的关系。方法:用不同浓度AGEs（PBS,AGEs 100μg/ml,AGEs 200μg/ml）处理人髓核细胞,或使用钙通道拮抗剂U73122,xestospongin C和Ryanodine预处理后。分别于0 h,12h,24 h三个时间点检测。分别用钙离子特异性探针Fluo 4/AM/Mag-Fluo 4/AM检测胞质内钙浓度/内质网内钙浓度,蛋白免疫印迹Western blot和实时定量荧光PCR检测内质网膜钙泵SERCA和钙通道IP3R和RyR的蛋白和转录表达水平,ELISA检测细胞内IP3表达水平,AnnexinV-APC/7-AAD染色流式检测髓核细胞凋亡率。结果:AGEs可以引起浓度依赖性和时间依赖性胞质钙超载和内质网钙耗竭,同时伴有钙泵SERCA蛋白和转录水平减低,钙通道IP3R和RyR蛋白和转录水平增高,细胞内IP3表达水平增高;使用钙... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

AGEs诱导人髓核细胞内游离钙分布转位

22图 2AGEs 诱导人髓核细胞内内质网钙泵及钙通道异常表达。使用浓度 AGEs（100μg/ml、200 μg/ml）处理人髓核细胞不同时间（0 h，12 h，24 h），PBS 作为阴性对照。（A）Western Blot及相对定量分析检测IP3R、RyR和SERCA的蛋白表达水平，GAPDH作为内参。（B）qPCR 检测 IP3R、RyR 和 SERCA 的 mRNA 表达水平，GAPDH 作为内参。（C）ELISA 法检测细胞内 IP3 表达水平。（D）超微量定磷法检测细胞内肌浆网酶 SERCA 的活性变化。数据采用均值±标准差表示，*p < 0.05 vs.对应 PBS 对照组，*p < 0.05 vs. 0 h 组。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文3.3 钙通道拮抗剂对 AGEs 介导的髓核细胞钙稳态失衡的影响随后，为了进一步探究钙通道在内质网钙稳态失衡中的关键作用，我们使用钙通道的拮抗剂 U73122，Xec 和 Rya，分别抑制 PLC 活性，减少 PIP2 水解生成 IP3，从而抑制 IP3 途径，和内质网钙离子 IP3R 和 RyR 通道。先用钙通道拮抗剂分别处理人髓核细胞后，再用 AGEs 200 μg/ml 处理 24 h。如图 3A、3B 流式分析结果显示，单独钙通道拮抗剂 U73122、Xec 和 Rya 处理，对髓核细报胞质钙和内质网钙浓度无明显影响，同时，钙通道拮抗剂预处理组与单独 AGEs 处理组相比，可明显缓解胞质钙超载和内质网耗竭（p<0.05）。上述结果说明，内质网钙通道功能异常在 AGEs 介导的髓核细胞内钙稳态失衡中具有重要作用，钙通道拮抗剂可部分缓解细胞内钙稳态失衡。


本文编号：3516839