基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建COL2A1基因突变所致软骨发育不全疾病猪模型

发布时间：2021-12-19 07:39

　　研究背景:遗传性骨骼疾病是由于调控骨骼软骨发育的基因发生突变而产生的一系列以骨骼发育异常为特征的疾病。近年研究发现,编码二型胶原蛋白的COL2A1基因是调控软骨发育的重要基因,且当COL2A1基因不同位点发生突变、或是突变类型不同时,会导致一系列严重程度差异很大的疾病表型,至今为止,COL2A1突变的病理学机制研究还没有得出非常明确的结论。CRISPR/Cas9是2013年新开发的基因编辑工具,其机制是在gRNA的引导下Cas9核酸内切酶能够准确寻找到目标位点并且高效切割DNA片段,这一工具为基因突变的研究提供了坚实的方法基础。近年来,遗传修饰猪模型在生物、医学和农业领域发挥了巨大的科研作用,通过基因修饰,猪模型可以作为人类疾病的模型和异种器官供体,为人类健康做贡献。本实验目标旨在构建携带有COL2A1基因突变的猪模型,用以进一步研究COL2A1基因突变猪的表型和致病机制。研究方法:1.设计多对靶向COL2A1基因27号外显子的gRNA,构建包含有gRNA和Cas9蛋白的质粒。2.收集猪胚胎并进行细胞分离和培养,获得符合转染条件的猪胚胎成纤维细胞。3.通过电转染的方式将gRNA/Cas... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

利用SCNT制备携带COL2A1突变的克隆猪（A）目标位点的氨基酸序列在不同物种之间是高度保守的

gRNA脱靶检测

第3章实验结果22和股骨头发育不全，且长骨骨骺质地柔软，干骺端边缘（尤其是关节结构的边缘）不清晰。KO仔猪的肋骨长度也短于WT仔猪，这导致胸腔空间狭窄（图3.4C）。图3.4D为前后肢长骨和肋骨的长度数据。图3.3COL2A1基因敲除（KO）仔猪的表型特征和骨骼X射线照片。（A）COL2A1KO仔猪和野生型（WT）仔猪出生后的外观对比图。（B）与WT仔猪相比，KO仔猪鼻部发育不全。（C）KO仔猪出现腭裂表现。（D）KO和WT仔猪的前肢和后肢具有明显长度差异。（E）KO和WT仔猪的平均体重、体长、鼻子长度和胸腹围比。（F）X线照片显示了KO仔猪全身骨骼发育异常。可观察鼻梁凹陷和上颌骨较短（黄色箭头所指），侧位X线片显示在KO仔猪中存在卵形椎体（蓝色箭头所指）。（G）与WT仔猪相比，KO仔猪的肋骨更薄更短，肩胛骨更小且分叉（黄色箭头所指），以及椎骨发育不良（蓝色箭头所指）。（H）KO仔猪的前肢骨骼不发达，可以观察到长骨变短，干骺端边缘不清晰（黄色箭头所指），掌骨和跖骨均变短（蓝色箭头所指）。


本文编号：3544030