化学重编程成纤维细胞为关节软骨细胞的效应和机制研究

发布时间：2021-12-28 15:34

　　关节软骨的退变会给患者带来严重的疼痛,会导致生活质量下降和劳动力丧失等,其对全球老龄人群的危害逐年上升。由于成年人关节软骨细胞再生能力低下、数量有限,寻找新的功能性软骨细胞来源成为关节软骨再生的关键。利用容易获取的成纤维细胞直接重编程（转分化）为软骨细胞,是一种快速、有效的再生手段。目前,已有科学家通过病毒过表达特定转录因子,成功诱导成纤维细胞成软骨细胞。然而,该方法不可避免的缺点包括:肿瘤生成、基因组突变、操作复杂等,为其临床应用带来了风险。小分子药物易于储存、运输,且容易扩散进入细胞,不完全依赖于递送载体。利用小分子药物组合调控细胞命运,是一种方便、安全的方法,更具应用前景。但是,利用小分子药物诱导生成关节软骨细胞的方法,目前尚待开发。为解决软骨细胞来源问题,在本研究中,我们通过筛选小分子药物组合的方法,建立成纤维细胞向软骨细胞转分化的诱导体系;利用三维培养技术,诱导成纤维细胞形成软骨细胞团;利用高通量单细胞测序技术,解析成纤维-软骨细胞重编程多时间点的细胞表型动态变化,探究这一复杂过程的分子机制;通过体内关节软骨修复模型,验证化学诱导软骨细胞的体内再生功能。我们的发现包括:1)组... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：155 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图0总体研究路线

基于小分子药物筛选建立成纤维-软骨细胞重编程系统

浙江大学博士学位论文第一章组合式筛选建立成纤维-软骨细胞重编程体系23使用方差分析计算整体差异，并结合Tukey检验计算两两差异或Dunnett检验计算和对照组间的差异；对于不符合正态分布或非连续变量多组之间数据的比较，使用Kruskal-Wallis检验计算整体差异，配合Dunns检验两两差异。所有数据表示平均数±标准误。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。1.4实验结果1.4.1成纤维-软骨细胞化学重编程基本模型的建立为建立化学重编程诱导体系，我们根据已有文献中的模型[48]，使用分步诱导的方法，转分化小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）为软骨细胞（如图1-2）。在第一阶段，即培养的第0-6天，我们利用三种常用转分化小分子化合物组合VCR（VPA、CHIR-98014和Repsox）及5%低浓度氧[48]处理成纤维细胞；在第二阶段，即培养的第7天起，更换培养基，利用软骨诱导培养基进行成软骨诱导。在诱导的终末阶段，即培养的第20天，用番红O-固绿染色的方式鉴定诱导结果。图1-2成纤维-软骨细胞重编程“两步法”诱导方案示意图Stage1,2：第一、二阶段；Day-2,0,20：开始诱导前2天、诱导第0天、第20天；Cellexpansion：细胞扩增；CocktailVCR&Hypoxia：VCR组合和低氧诱导；ChondrogenicMedium：成软骨培养基；MEFs：小鼠胚胎成纤维细胞；SafraninOStaining：番红O染色。番红O-固绿染色可以区分软骨的细胞外基质和纤维/骨组织的胞外基质[91]。用成纤维细胞和小鼠间充质干细胞分别进行软骨分化诱导后，番红O-固绿染色


本文编号：3554308