外周血间充质干细胞诱导巨噬细胞极化与重编程的体外研究

发布时间：2017-05-12 15:20

  本文关键词：外周血间充质干细胞诱导巨噬细胞极化与重编程的体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察外周血来源的间充质干细胞(Peripheral Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells,PB-MSCs)对巨噬细胞免疫修饰作用的影响并初步探索其分子调节机制。方法:1、大鼠PB-MSCs及骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSC)的分离培养与鉴定:SPF级SD大鼠10只(150-250 g),腹腔注射100μg·kg-1·d 1粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF),连续给药5 d,于最后一次注射后,立即腹腔注射5 mg·kg 1AMD3100,1 h之后分别采集骨髓和外周血,密度梯度离心法收集骨髓单个核细胞(BM-MNCs)和外周血单个核细胞(PB-MNCs),其中PB-MNCs以5×106个/ml细胞密度接种于含15%FBS的MSCs适应性培养基(ACM)/HG-DMEM(V ACM:V HG-DMEM=1:1)中,BM-MNCs以5×106个/ml细胞密度接种于15%FBS的HG-DMEM中,经传代培养纯化BM-MSCs和PB-MSCs。取第三代BM-MSCs和PB-MSCs,采用流式细胞术检测两种细胞的CD34、CD45、CD90、CD44、CD29、G-CSFR表型特征,之后,再分别行成脂、成骨诱导分化培养,油红O、茜素红染色进行鉴定;荧光定量PCR(Q-PCR)分别检测两种细胞的成骨分化相关基因Runx2、SOX2、BSP和成脂分化有关基因Wnt 5b、PPARγ的m RNA表达情况,并对巨噬细胞IL-6、IL-1β、IFNγ、IL-10、TGF-β炎症因子m RNA表达进行检测;Western blot检测两种细胞炎症调节相关核转录因子Twist1的表达。2、大鼠M0型巨噬细胞的分离、培养与诱导分化为M1和M2型巨噬细胞:用含20%L929细胞条件培养基、10%FBS的RIPM-1640培养基培养大鼠骨髓细胞(1×105个/ml密度接种),6天后得到纯化的M0型巨噬细胞,分别采用LPS或IL-4联合IL-10诱导24 h,得到M1和M2型巨噬细胞。3、PB-MSCs对M0型巨噬细胞诱导极化能力研究:采用PB-MSCs与M0型巨噬细胞间接共培养实验进行分析,实验分组包括:对照组(M0)、LPS诱导组(M1)、IL-4+IL-10诱导组(M2)、PB-MSCs与M0巨噬细胞共培养组(M P-T)、BM-MSCs与M0巨噬细胞共培养组(M B-T),其中PB-MSCs或BM-MSCs(1×105个)接种于Transwell小室中并与M0型巨噬细胞(1×105个)进行共培养3天,Q-PCR检测巨噬细胞IL-6、IL-10、IL-1β、CCL22、TGF-β等基因m RNA表达特点,流式细胞术分析巨噬细胞CD206、CD68、CD11b、i NOS、Arginase 1、TNFα的表型特征。4、PB-MSCs对M1型巨噬细胞重编程能力研究:实验分为采用PB-MSCs和BM-MSCs与M1型巨噬细胞直接共培养(分别为M P-C和M B-C两个组),PB-MSCs或BM-MSCs(1×105个)直接接种于已贴壁的M1型巨噬细胞(1×105个)中进行共培养,3天后使用流式细胞术分析CD11b阳性巨噬细胞CD206、i NOS、Arginase 1、TNFα的表达情况,二氢乙啶(DHE)染色分析活性氧簇(ROS)的表达。结果:1、分离培养的大鼠PB-MSC与BM-MSCs形态成纤维样细胞样,均不同程度表达CD90、CD44、CD29、G-CSFR,不表达CD34、CD45;成脂定向诱导后,油红O染色可见脂滴形成,成骨定向诱导后,茜素S染色可见磷酸盐结晶,但在相同的诱导天数时PB-MSCs较BM-MSCs形成的脂滴更大且较多,而磷酸盐结晶却少于BM-MSCs。2、Q-PCR检测发现,与BM-MSCs相比,PB-MSCs的Runx2、SOX2、BSP等成骨相关基因表达较低,而成脂相关基因Wnt 5b、PPARγ表达较高。3、Q-PCR进一步分析发现,PB-MSC与BM-MSCs相比,IL-6、IL-1β、IFNγ、TGF-β表达较低,而IL-10表达较高,而Western blot显示PB-MSCs的twist1蛋白表达水平低于BM-MSCs。4、在Transwell间接共培养体系下,PB-MSCs和BM-MSCs均可诱导M0型巨噬细胞向M2型极化,表现为CD206、CD68、CD11b、Arg-1、IL-10表达上调,而i NOS、TNFα、IL-6、IL-1β、CCL22表达下调。间接共培养后的巨噬细胞M P-T较M B-T相比CD206、CD68、CD11b、Arg-1、IL-10、CCL22表达较高,而i NOS、TNFα、IL-6、IL-1β表达较低。5、在直接共培养体系中,PB-MSCs和BM-MSCs均可使M1巨噬细胞向M2型转变,表现为代表M2型巨噬细胞型别的指标CD206表达上调,M1型巨噬细胞TNFα表达下调,代表巨噬细胞代谢水平的指标i NOS表达降低,Arg-1表达升高,代表ROS水平DHE染色下降。直接共培养后的巨噬细胞MP-C较MB-C相比CD206、Arg-1表达较高,而i NOS、TNFα、DHE表达较低,表明PB-MSCs诱导巨噬细胞向M2方向的作用明显强于BM-MSCs。结论:本研究成功的从动员的大鼠外周血中分离得到了具有典型形态特征、免疫表型、多向分化潜能的MSCs细胞。PB-MSCs与BM-MSCs相比分化能力减弱,但在炎症因子表达谱、对巨噬细胞向M2型方向极化和重编程上却表现出更强的能力。本研究的结果证实了PB-MSCs改变巨噬细胞的炎症型别与细胞因子分泌和直接接触发生重编程有关,意味着PB-MSCs与BM-MSCs相比可能更适合于脊髓损伤(SCI)等疾病的抗炎治疗。
【关键词】：外周血间充质干细胞 巨噬细胞 极化 重编程
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.2
【目录】：

• 中英缩略词对照表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-31
• 结果31-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 参考文献45-48
• 综述48-55
• 参考文献51-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

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本文编号：360150