高通量筛选分阶段腱系诱导体系及组织工程修复策略的研究

发布时间：2023-03-01 09:42

　　肌腱干细胞(TSPC)是肌腱组织工程与再生中的潜在种子细胞,但体外培养过程中TSPCs极易丢失表型。基于小分子药物易于合成、保存和质量控制的优势,本研究探索利用高通量筛选获得用于TSPCs体外扩增和表型维持的小分子化合物,建立稳定培养体系。我们利用Scx GFP荧光可视化报告系统对FDA批准的小分子库和生物活性库中的小分子进行高通量筛选,获得TSPCs表型维持的候选分子群,复筛进一步验证阳性小分子。我们优化每个分子的浓度,得到维持表型并启动腱系分化的最佳小分子组合。结果发现小分子组合在维持表型的同时不能促进细胞增殖。因此,本课题进一步通过高内涵细胞分析筛选得到促进细胞增殖的小分子。之后我们用单细胞分析手段进行分化确认,并通过比较实验获得腱系分化诱导的最佳小分子组合。基于以上发现,我们建立了TSPCs分阶段培养诱导策略,第一步利用小分子先促进细胞增殖,第二步利用小分子组合进行腱系分化诱导,并进一步结合生物相容性的水凝胶材料实现体内的应用。我们通过3D打印技术将分阶段诱导的活细胞与水凝胶结合在一起,在体内促进肌腱再生与修复。综上所述,本课题建立了分阶段诱导TSPCs分化的小分子策略,并结合...

【文章页数】：113 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略词
绪论
1 高通量筛选肌腱干细胞表型维持和体外扩增的小分子及组合
    1.1 引言
    1.2 实验试剂与仪器
        1.2.1 材料和试剂
        1.2.2 实验仪器
        1.2.3 试剂配制
    1.3 实验方法
        1.3.1 TSPCs分离培养
        1.3.2 细胞复苏
        1.3.3 细胞传代
        1.3.4 细胞冻存
        1.3.5 DAPI染色
        1.3.6 高内涵筛选
        1.3.7 细胞增殖检测
        1.3.8 统计学分析
    1.4 实验结果
        1.4.1 肌腱干细胞在体外培养过程中表型逐渐丢失
        1.4.2 初筛获得六十种维持肌腱干细胞表型的小分子
        1.4.3 复筛获得八种维持肌腱干细胞表型的小分子
        1.4.4 组合筛选获得五种有效维持肌腱干细胞表型的小分子组合
        1.4.5 高通量筛选获得六种促进肌腱干细胞体外扩增的小分子
    1.5 讨论
2 高通量qPCR评估小分子及组合促进肌腱干细胞体外扩增和表型维持的效果
    2.1 引言
    2.2 实验试剂与仪器
        2.2.1 材料和试剂
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 试剂配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 cDNA制备
        2.3.2 引物设计
        2.3.3 BioMark上机
        2.3.4 其余方法同第一章
    2.4 实验结果
        2.4.1 聚类分析显示不同处理组间的基因差异
        2.4.2 主成分分析揭示四种细胞亚群
        2.4.3 分析各亚群特异表达的基因
        2.4.4 表型维持小分子及组合对关键腱系基因表达的影响
        2.4.5 促增殖小分子对关键基因表达的影响
    2.5 讨论
3 建立肌腱干细胞表型维持及分阶段腱系诱导策略
    3.1 引言
    3.2 实验试剂与仪器
        3.2.1 材料和试剂
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 试剂配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 试剂盒提取RNA
        3.3.2 实时荧光定量PCR
        3.3.3 细胞免疫荧光
        3.3.4 组织工程肌腱构建
        3.3.5 HE染色
        3.3.6 Masson染色
        3.3.7 天狼星红染色
        3.3.8 三系分化诱导
        3.3.9 ALP染色
        3.3.10 SO染色
        3.3.11 其余方法同第一、二章
    3.4 实验结果
        3.4.1 五种小分子组合的效果比较
        3.4.2 确立促进腱系分化的最佳小分子组合C1
        3.4.3 小分子组合C1的效果验证
        3.4.4 建立小分子分阶段腱系诱导体系
    3.5 讨论
4 小分子分阶段腱系诱导策略结合水凝胶体系修复肌腱损伤
    4.1 引言
    4.2 实验试剂与仪器
        4.2.1 材料和试剂
        4.2.2 实验仪器
        4.2.3 试剂配制
        4.2.4 实验动物
    4.3 实验方法
        4.3.1 浸提液检测胶体毒性
        4.3.2 扫描电镜
        4.3.3 细胞骨架染色
        4.3.4 死活细胞染色
        4.3.5 皮下埋入动物模型的建立
        4.3.6 髌腱缺损动物模型的建立
        4.3.7 细胞追踪CM-Dil染色
        4.3.8 胶体制备及3D打印
        4.3.9 组织学检测
        4.3.10 组织免疫荧光
        4.3.11 Trizol法提取RNA
        4.3.12 透射电镜
        4.3.13 胶原纤维直径测量
        4.3.14 力学测试
        4.3.15 其余方法同第一、二、三章
    4.4 实验结果
        4.4.1 Gel MA和 HA-NB复合水凝胶材料表征
        4.4.2 异位肌腱再生两周后的效果评估
        4.4.3 异位肌腱再生四周后的效果评估
        4.4.4 原位肌腱修复两周后的效果评估
        4.4.5 原位肌腱修复四周后的效果评估
    4.5 讨论
5 总结
参考文献
综述 生物活性分子调控干细胞命运用于肌腱再生
    参考文献
作者简历及在学期间所取得的科研成果



本文编号：3751893