TSG-6慢病毒表达及干扰载体的构建及其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响

发布时间：2017-05-19 11:02

  本文关键词：TSG-6慢病毒表达及干扰载体的构建及其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景组织损伤后的瘢痕形成等纤维化病理过程可归因于炎症反应,其病变程度也与炎症反应密切相关。肿瘤坏死因子α刺激基因-6(tumor necrosis factorαstimulated gene 6,TSG-6)已被证实具有抗炎作用,同时,在早期创面局部注射TSG-6蛋白可明显抑制瘢痕的形成。故TSG-6基因及其表达或可与瘢痕的形成过程相关,但TSG-6蛋白参与瘢痕形成的机制尚不明确。目的本实验旨在通过分离培养人源瘢痕疙瘩成纤维细胞并构建人TSG-6重组慢病毒表达载体与干扰载体,以此建立稳定转染的TSG-6过表达及干扰表达的瘢痕疙瘩成纤维细胞株,观察TSG-6表达水平对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖效应与凋亡效应的影响,并进一步探讨其可能的作用机制。方法采用酶消化法分离提取并纯化培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞(human keloid fibroblast,HKF),再以免疫组织化学法鉴定。构建p LVX-puro-TSG-6及p LVX-sh RNA1-TSG-6重组慢病毒载体,感染HKF细胞后,以逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与蛋白印迹检测(Western blot,WB)检验各组细胞TSG-6基因在m RNA水平及蛋白质水平的表达情况。后以MTT法和流式细胞术检测转染后不同时间段内各组细胞的增殖与凋亡情况,并分别以PCR及WB检测各组细胞中Bcl-2、P53及Active-caspase-3的表达。结果与结论成功分离原代人瘢痕疙瘩成纤维细胞,光学显微镜下细胞多呈梭形,传至五代后行波形蛋白的免疫组织化学染色,阳性率为100%,细胞角蛋白染色阴性。重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功,细胞中TSG-6的表达发生明显变化。与对照组相比,TSG-6过表达组细胞增殖减缓,凋亡率显著升高,TSG-6干扰组细胞增殖加快,细胞凋亡率降低(P0.05)。Western blot结果提示,TSG-6过表达组Bcl-2表达显著降低,P53及Active-caspase-3明显上升(P0.05)。结果表明,TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,且其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达、上调P53蛋白表达、升高Caspase-3活性有关。
【关键词】：TSG-6基因 瘢痕疙瘩 成纤维细胞 RNA干扰 过表达 慢病毒 细胞增殖 细胞凋亡
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R622
【目录】：

• 中英文缩略词表5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-13
• 2 材料与方法13-23
• 3 结果23-29
• 4 讨论29-33
• 5 结论33-34
• 6 参考文献34-38
• 附录38-40
• 致谢40-41
• 综述41-50
• 参考文献46-50

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本文编号：378487