MFRN1缺失参与miR-7诱导横纹肌肉瘤细胞死亡的机制研究
发布时间：2023-06-02 01:25
横纹肌肉瘤(Rhabdomyoscarcoma,RMS)是一种未成年人多发性的横纹肌样恶性肿瘤,具有横纹成肌细胞特性,拥有不同程度的分化潜能,并且细胞凋亡的关键上游诱导过程存在失调现象,因而具有凋亡抗性。抗RMS治疗包括手术,放疗和联合化疗。尽管这些策略提高了存活率,由于缺乏针对性治疗,治疗率一直停滞不前。此外,流行的治疗方法具有抗药性和转移性,导致几种治疗方案的失败。对于高风险RMS,显然需要开发新颖的、更具针对性与安全性的疗法。线粒体在肿瘤生长和进展中扮演重要角色,因为它们在癌症新陈代谢和细胞存活途径的调节中具有特殊作用。线粒体可通过调控铁稳态为各种细胞反应进程提供能量及物质基础,控制氧化还原等,并且参与诱导多种调节性细胞死亡(regulated cell death,RCD),其中线粒体膜通透性转换(mitochondrial permeability transition,MPT)驱动的死亡与线粒体改变尤为相关。以线粒体作为靶标的癌症治疗策略已显示出广阔的前景,同时也对治疗拥有凋亡抗性的癌症细胞具有重要意义。作为具有横纹肌特性的恶性肿瘤,横纹肌肉瘤的生长和存活可能高度依赖于线粒...
【文章页数】：89 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 横纹肌肉瘤概述
1.1.1 横纹肌肉瘤病理生理及分子生物学特点
1.1.2 横纹肌肉瘤中关键功能通路的变化
1.1.3 横纹肌肉瘤的治疗和预后
1.1.4 MicroRNA-7与横纹肌肉瘤
1.2 线粒体及其铁离子稳态
1.2.1 线粒体基本结构与功能
1.2.2 线粒体铁离子吸收及利用
1.2.3 线粒体铁离子稳态对线粒体功能的影响
1.3 线粒体参与诱导的细胞死亡类型
1.3.1 凋亡
1.3.2 坏死性凋亡
1.3.3 铁死亡
1.3.4 线粒体膜通透性转换孔介导的死亡
1.4 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞系
2.1.2 实验动物
2.1.3 药品与试剂
2.1.4 耗材与仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养、瞬时转染及药物处理
2.2.2 CRISPR基因敲除实验
2.2.3 细胞活力、集落形成及细胞死亡测定
2.2.4 实时定量PCR、载体构建及双荧光素酶实验
2.2.5 蛋白免疫印迹及免疫共沉淀
2.2.6 胞质与线粒体分离实验
2.2.7 线粒体形态、膜电位、ROS和ATP含量检测
2.2.8 线粒体内膜通透性及铁离子浓度检测
2.2.9 转录组测序及分析
2.2.10 裸鼠成瘤实验
2.2.11 统计分析
3 结果与分析
3.1 MiR-7在横纹肌肉瘤中的抑癌作用及靶基因验证
3.1.1 MiR-7在体外对横纹肌肉瘤的抑制作用
3.1.2 MiR-7在体内对横纹肌肉瘤的抑制作用
3.1.3 MiR-7介导横纹肌肉瘤细胞死亡的线粒体靶基因验证
3.1.4 小结
3.2 MFRN1缺失诱导MLKL依赖性横纹肌肉瘤细胞死亡
3.2.1 MFRN1缺失诱导横纹肌肉瘤细胞死亡
3.2.2 多种正常细胞系对MFRN1缺失不敏感
3.2.3 MFRN1缺失诱导的细胞膜破裂依赖于MLKL的磷酸化
3.2.4 小结
3.3 线粒体先于MLKL感应MFRN1缺失的致死信号
3.3.1 MFRN1缺失引起线粒体相关基因表达异常
3.3.2 MFRN1缺失对线粒体膜电位、ATP及ROS水平的影响
3.3.3 MFRN1缺失诱导的线粒体损伤先于MLKL磷酸化
3.3.4 小结
3.4 MPT参与MFRN1缺失导致的线粒体损伤及死亡
3.4.1 干涉CypD能缓解MFRN1缺失介导的致死效应
3.4.2 抑制CypD活性能阻止MFRN1缺失介导的线粒体损伤
3.4.3 MFRN1缺失引起线粒体内膜通透性增加
3.4.4 MFRN1缺失导致CypD的线粒体积累增加及磷酸化水平升高
3.4.5 小结
3.5 MFRN1抑制mPTP开放的蛋白特性
3.5.1 MFRN1的线粒体铁转运特性参与对MPT的抑制
3.5.2 MFRN1通过与CypD的结合参与对MPT的抑制
3.5.3 小结
4 讨论
4.1 MiR-7及其靶基因MFRN1下调对横纹肌肉瘤的抗癌作用
4.2 MFRN1缺失的致死机制
4.3 MFRN1与横纹肌肉瘤线粒体功能维持及细胞存活
4.4 MFRN1与MPT
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3827396
【文章页数】：89 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 横纹肌肉瘤概述
1.1.1 横纹肌肉瘤病理生理及分子生物学特点
1.1.2 横纹肌肉瘤中关键功能通路的变化
1.1.3 横纹肌肉瘤的治疗和预后
1.1.4 MicroRNA-7与横纹肌肉瘤
1.2 线粒体及其铁离子稳态
1.2.1 线粒体基本结构与功能
1.2.2 线粒体铁离子吸收及利用
1.2.3 线粒体铁离子稳态对线粒体功能的影响
1.3 线粒体参与诱导的细胞死亡类型
1.3.1 凋亡
1.3.2 坏死性凋亡
1.3.3 铁死亡
1.3.4 线粒体膜通透性转换孔介导的死亡
1.4 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞系
2.1.2 实验动物
2.1.3 药品与试剂
2.1.4 耗材与仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养、瞬时转染及药物处理
2.2.2 CRISPR基因敲除实验
2.2.3 细胞活力、集落形成及细胞死亡测定
2.2.4 实时定量PCR、载体构建及双荧光素酶实验
2.2.5 蛋白免疫印迹及免疫共沉淀
2.2.6 胞质与线粒体分离实验
2.2.7 线粒体形态、膜电位、ROS和ATP含量检测
2.2.8 线粒体内膜通透性及铁离子浓度检测
2.2.9 转录组测序及分析
2.2.10 裸鼠成瘤实验
2.2.11 统计分析
3 结果与分析
3.1 MiR-7在横纹肌肉瘤中的抑癌作用及靶基因验证
3.1.1 MiR-7在体外对横纹肌肉瘤的抑制作用
3.1.2 MiR-7在体内对横纹肌肉瘤的抑制作用
3.1.3 MiR-7介导横纹肌肉瘤细胞死亡的线粒体靶基因验证
3.1.4 小结
3.2 MFRN1缺失诱导MLKL依赖性横纹肌肉瘤细胞死亡
3.2.1 MFRN1缺失诱导横纹肌肉瘤细胞死亡
3.2.2 多种正常细胞系对MFRN1缺失不敏感
3.2.3 MFRN1缺失诱导的细胞膜破裂依赖于MLKL的磷酸化
3.2.4 小结
3.3 线粒体先于MLKL感应MFRN1缺失的致死信号
3.3.1 MFRN1缺失引起线粒体相关基因表达异常
3.3.2 MFRN1缺失对线粒体膜电位、ATP及ROS水平的影响
3.3.3 MFRN1缺失诱导的线粒体损伤先于MLKL磷酸化
3.3.4 小结
3.4 MPT参与MFRN1缺失导致的线粒体损伤及死亡
3.4.1 干涉CypD能缓解MFRN1缺失介导的致死效应
3.4.2 抑制CypD活性能阻止MFRN1缺失介导的线粒体损伤
3.4.3 MFRN1缺失引起线粒体内膜通透性增加
3.4.4 MFRN1缺失导致CypD的线粒体积累增加及磷酸化水平升高
3.4.5 小结
3.5 MFRN1抑制mPTP开放的蛋白特性
3.5.1 MFRN1的线粒体铁转运特性参与对MPT的抑制
3.5.2 MFRN1通过与CypD的结合参与对MPT的抑制
3.5.3 小结
4 讨论
4.1 MiR-7及其靶基因MFRN1下调对横纹肌肉瘤的抗癌作用
4.2 MFRN1缺失的致死机制
4.3 MFRN1与横纹肌肉瘤线粒体功能维持及细胞存活
4.4 MFRN1与MPT
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3827396
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