Lnc247对骨骼肌损伤修复调控作用的研究

发布时间：2023-06-04 04:17

　　长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一种由RNA聚合酶Ⅱ指导转录形成的一类长度大于200bp而小于100kb的RNA分子。转录组测序发现的长链非编码RNA Lnc247为Foxk1的天然反义LncRNA。Foxk1基因在调控骨骼肌卫星细胞的增殖分化方面具有重要作用,因此,研究Lnc247的功能可为揭示lncRNA在骨骼肌损伤修复中的调控作用提供依据。本论文采用分子生物学、组织化学、转录组和生物信息学分析等多种研究手段,围绕Lnc247对骨骼肌再生过程中重要的转录调控因子Foxk1的作用及对骨骼肌损伤修复的影响进行了研究。1.用高性能的可视化工具——整合基因组浏览器(Integrative Genomics Viewer IGV)和UCSC的BLAT功能分析发现Lnc247与Foxk1的部分3′UTR区域反向互补,表明Lnc247为Foxk1的天然反义lncRNA。2.采用腺病毒相关病毒(AAV)在胫骨前肌中过表达Lnc247,Western Blot结果显示,Foxk1的蛋白水平显著低于对照组,表明过表达Lnc247对Foxk1基因的表达具有负调控作...

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 骨骼肌概述
        1.1.1 骨骼肌在畜牧业中的应用
        1.1.2 骨骼肌对人类生命活动的影响
        1.1.3 肌卫星细胞的发现和作用
    1.2 LncRNA概述
        1.2.1 LncRNA简介
        1.2.2 LncRNA在癌症中的作用
        1.2.3 LncRNA在神经退行性疾病中的作用
        1.2.4 LncRNA的靶基因Foxk1 简介
    1.3 LncRNA在骨骼肌发生过程中的作用
        1.3.1 与染色质相互作用调控骨骼肌分化
        1.3.2 与蛋白质相互作用调控骨骼肌分化
        1.3.3 与其他RNA相互作用调控骨骼肌分化
    1.4 LncRNA与其编码的微肽对骨骼肌的调控
    1.5 在骨骼肌疾病中的作用
        1.5.1 LncRNA与 DMD
        1.5.2 LncRNA与 FSHD
        1.5.3 LncRNA与骨骼肌肥大性疾病
        1.5.4 LncRNA与肌萎缩侧索硬化症
    1.6 与LncRNA有关的临床治疗方法
        1.6.1 腺病毒和慢病毒治疗途径
        1.6.2 反义寡核苷酸治疗
    1.7 本论文研究意义
第二章 实验动物与耗材
    2.1 实验动物
    2.2 实验耗材与试剂
    2.3 实验设备与仪器
    2.4 抗体信息
    2.5 引物信息
第三章 实验方法与步骤
    3.1 麻醉剂的配制
        3.1.1 主要试剂
        3.1.2 麻醉步骤
    3.2 基因表达量的分析
        3.2.1 主要试剂
        3.2.2 小鼠组织总RNA的提取
        3.2.3 反转录RNA
        3.2.4 PCR反应
        3.2.5 qPCR反应
    3.3 确定AAV的合适注射剂量
        3.3.1 主要试剂
        3.3.2 注射方法
        3.3.3 腺相关病毒载体(血清型:8 型)
        3.3.4 SiRNA信息
    3.4 组织石蜡切片和H&E染色
        3.4.1 主要试剂
        3.4.2 组织石蜡切片
        3.4.3 H&E染色步骤
    3.5 蛋白表达量分析
        3.5.1 主要试剂
        3.5.2 细胞总蛋白的提取
        3.5.3 蛋白浓度的测定
        3.5.4 WB操作步骤
    3.6 小鼠过表达损伤模型的构建
        3.6.1 主要试剂
        3.6.2 构建步骤
    3.7 测序数据的生物信息学分析
        3.7.1 不同处理情况样本无监督聚类
        3.7.2 差异表达基因GO功能注释和KEGG通路分析
第四章 实验结果
    4.1 Lnc247与Foxk1 基因的关系
        4.1.1 Lnc247 序列信息
        4.1.2 Lnc247为Foxk1 天然反义LncRNA
    4.2 Lnc247与Foxk1 基因在小鼠体内表达情况
        4.2.1 Lnc247 的蛋白编码能力分析结果
        4.2.2 Lnc247和Foxk1 在小鼠肌肉组织中的表达情况
    4.3 Lnc247 过表达与敲低的腺相关病毒感染胫骨前肌
        4.3.1 过表达Lnc247 病毒感染胫骨前肌结果
        4.3.2 敲低Lnc247 病毒感染胫骨前肌后总RNA的提取
        4.3.3 敲低Lnc247 病毒感染后总RNA反转录结果
        4.3.4 敲低Lnc247 病毒感染胫骨前肌结果
    4.4 重金属离子对小鼠胫骨前肌的损伤
    4.5 过表达Lnc247 抑制Foxk1 基因的表达
    4.6 过表达Lnc247 促进肌卫星细胞的肌源性分化
    4.7 过表达Lnc247 促进受损肌纤维的修复
        4.7.1 损伤修复第三天过表达组e-MHC表达量升高
        4.7.2 损伤修复第七天过表达组e-MHC表达量降低
        4.7.3 过表达损伤组再生肌纤维面积比对照组大
    4.8 RNA-seq转录组测序数据的初步分析
        4.8.1 测序样本名称及意义
        4.8.2 琼脂糖凝胶电泳检测测序样本质量
        4.8.3 无监督聚类分析
        4.8.4 GO基因功能富集分析和KEGG通路分析
第五章 结论与展望
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果



本文编号：3830673