人骨髓间充质干细胞和PLGA/TCP材料复合物在饲喂—培养灌流细胞罐中的成骨和成软骨分化

发布时间：2023-11-10 19:11

　　骨组织工程是一个涉及到多种学科的交叉研究领域,在骨缺损、骨不连等疾病的修复和重建治疗方面它已经展示了良好的发展前景。目前,骨组织工程的研究主要集中于以下三个方面:(1)种子细胞的研究;(2)生物支架材料的研究;(3)工程化骨组织的体外构建。细胞-支架材料复合物的体外构建是骨组织工程中最重要的环节之一。我们实验室有关“个性化骨组织的细胞罐培养及其在动物中的应用研究”课题也主要围绕细胞-支架材料复合物的体外构建进行。本论文选择人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞。我们验证了hBMSCs在进行孔板培养时的增殖能力、成骨分化和成软骨分化能力,hBMSCs进行成骨分化和成软骨分化后的染色实验、重要生化指标分析和标志基因的蛋白表达检测均表明,成骨和成软骨分化组相较于对照组,在细胞形态、重要生化指标和标志基因的蛋白表达上均发生了显著的变化,呈现出明显的分化趋势,证实了hBMSCs作为种子细胞的可行性。本论文针对四种细胞因子包括促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(NGF)、胰岛素类生长因子-1(IGF-1)和β-干扰素(IFN-β)进行诱导hBMSCs成软骨分化的检测,筛选出能促进hBM...

【文章页数】：130 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文对照和缩略词表
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 种子细胞
        1.2.1 种子细胞的来源
            1.2.1.1 骨
            1.2.1.2 骨膜
            1.2.1.3 骨髓
            1.2.1.4 骨外组织
        1.2.2 种子细胞的种类
            1.2.2.1 成骨细胞
            1.2.2.2 间充质干细胞
            1.2.2.3 胚胎干细胞
            1.2.2.4 基因修饰种子细胞
    1.3 生物支架材料
        1.3.1 天然生物材料
            1.3.1.1 甲壳素和壳聚糖
            1.3.1.2 胶原和明胶
            1.3.1.3 透明质酸
            1.3.1.4 纤维蛋白
            1.3.1.5 海藻酸盐
            1.3.1.6 淀粉
            1.3.1.7 珊瑚
        1.3.2 人工合成生物材料
            1.3.2.1 羟基磷灰石
            1.3.2.2 磷酸钙水泥
            1.3.2.3 磷酸三钙
            1.3.2.4 生物活性玻璃
            1.3.2.5 脂肪族聚酯
            1.3.2.6 聚氨酯
            1.3.2.7 聚酸酐
            1.3.2.8 氨基酸聚合物
            1.3.2.9 氧化乙烯类
        1.3.3 纳米材料
        1.3.4 复合材料
    1.4 工程化骨组织的构建
        1.4.1 生物反应器
            1.4.1.1 机械搅拌式生物反应器
            1.4.1.2 灌注式生物反应器
            1.4.1.3 气升式生物反应器
            1.4.1.4 膜式生物反应器
            1.4.1.5 旋转壁式生物反应器
            1.4.1.6 微载体型生物反应器
            1.4.1.7 体内生物反应器
        1.4.2 种子细胞-材料复合物的三维动态构建
    1.5 骨组织工程的临床应用
    1.6 本论文的研究内容及研究意义
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究意义
第二章 人骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力验证
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 种子细胞
        2.2.2 hBMSCs成骨分化和成软骨分化培养基
        2.2.3 其他试剂，耗材和仪器
    2.3 溶液配制
    2.4 细胞的基本操作
        2.4.1 细胞复苏
        2.4.2 细胞传代
        2.4.3 细胞冻存
    2.5 实验方法
        2.5.1 hBMSCs生长的形态观察
        2.5.2 hBMSCs增殖的计数方法
        2.5.3 hBMSCs在孔板平面上的成骨和成软骨分化
        2.5.4 VON KASSA染色
        2.5.5 Alcain blue染色
        2.5.6 hBMSCs碱性磷酸酶（ALP）活性测定
        2.5.7 hBMSCs糖胺多糖（GAG）总含量测定
        2.5.8 Western blotting方法检测成骨分化和成软骨分化标记蛋白
        2.5.9 统计分析方法
    2.6 结果与讨论
        2.6.1 hBMSCs增殖时的形态变化
        2.6.2 hBMSCs增殖的数量规律
        2.6.3 hBMSCs分化期间的形态变化
        2.6.4 hBMSCs分化期间染色检测结果与分析
        2.6.5 hBMSCs分化期间相关生化指标检测结果与分析
        2.6.6 hBMSCs分化期间相关标志基因蛋白表达检测结果
    2.7 本章小结
第三章 细胞因子对HBMSCS分化的影响
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 种子细胞
        3.2.2 细胞成软骨分化培养基
        3.2.3 细胞因子
        3.2.4 试剂，耗材和仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 单独使用四种细胞因子
        3.3.2 使用IFN-β 和TGF-β3 的不同组合
        3.3.3 使用TGF-β3 和不同浓度IFN-β 的组合
        3.3.4 Alcain blue染色
        3.3.5 hBMSCs糖胺聚糖（GAG）总含量的测定
        3.3.6 成软骨分化标志基因的荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测
            3.3.6.1 总RNA抽提
            3.3.6.2 去基因组
            3.3.6.3 总RNA纯度和完整性检测
            3.3.6.4 逆转录
            3.3.6.5 定量PCR
        3.3.7 Western blotting方法检测成软骨分化标志蛋白
        3.3.8 统计分析方法
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 单独使用四种细胞因子时对hBMSCs成软骨分化的影响
        3.4.2 IFN-β 和TGF-β3 的不同组合对hBMSCs成软骨分化的影响
        3.4.3 TGF-β3 和不同浓度IFN-β 的组合对h BMSCs成软骨分化的影响
    3.5 本章小结
第四章 PLGA/TCP材料的体外生物相容性和体内生物安全性研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 种子细胞
        4.2.2 细胞成骨分化培养基
        4.2.3 PLGA/TCP材料
            4.2.3.1 PLGA/TCP材料生理盐水浸提液
            4.2.3.2 PLGA/TCP材料棉籽油浸提液
        4.2.4 实验动物
        4.2.5 试剂，耗材和仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 hBMSCs和PLGA/TCP材料在体外的生物相容性检验
            4.3.1.1 hBMSCs在PLGA/TCP材料上的接种和换液
            4.3.1.2 hBMSCs在PLGA/TCP材料上增殖和成骨分化的扫描电镜检测
            4.3.1.3 MTT检测hBMSCs在PLGA/TCP材料上的增殖
            4.3.1.4 hBMSCs在PLGA/TCP材料上成骨分化的ALP酶活性检测
        4.3.2 PLGA/TCP材料在动物体内的生物安全性检验
            4.3.2.1 热原实验
            4.3.2.2 溶血实验
            4.3.2.3 急性全身毒性实验
            4.3.2.4 皮内刺激反应实验
            4.3.2.5 皮下植入实验
        4.3.3 统计分析方法
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 hBMSCs和PLGA/TCP材料的生物相容性实验结果
            4.4.1.1 hBMSCs在PLGA/TCP材料上增殖的检测结果
            4.4.1.2 hBMSCs在PLGA/TCP材料上的成骨分化效果
        4.4.2 PLGA/TCP材料在动物体内的生物安全性实验结果
            4.4.2.1 PLGA/TCP材料的热原测试结果
            4.4.2.2 PLGA/TCP材料的溶血实验结果
            4.4.2.3 PLGA/TCP材料的急性全身毒性实验结果
            4.4.2.4 皮内刺激反应实验结果
            4.4.2.5 皮下植入实验结果
    4.5 本章小结
第五章 饲喂-培养灌流细胞罐体外制备成骨和成软骨复合物
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 种子细胞
        5.2.2 hBMSCs成骨分化和成软骨分化培养基
        5.2.3 细胞因子
        5.2.4 PLGA/TCP支架
        5.2.5 饲喂-培养灌流细胞罐系统
        5.2.6 试剂，耗材和仪器
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞罐的安装和无菌测试
        5.3.2 hBMSCs在孔板中的静态培养
        5.3.3 hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物在细胞罐中的动态培养分化
        5.3.4 扫描电镜检测hBMSCs的成骨分化和成软骨分化状态
        5.3.5 ALP酶活性检测hBMSCs的成骨分化水平
        5.3.6 GAG总含量检测hBMSCs的成软骨分化水平
        5.3.7 qRT-PCR方法检测hBMSCs成骨和成软骨分化标志基因的表达量
        5.3.8 Western blotting方法检测hBMSCs成骨和成软骨分化标志蛋白的表达量
        5.3.9 统计分析方法
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 细胞罐各参数的实时控制
        5.4.2 细胞罐中hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物的成骨分化和成软骨分化效果
    5.5 本章小结
结论与展望
参考文献
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：3862147