基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

发布时间：2023-11-11 13:06

　　供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-人异种肝脏移植面临诸多障碍,其中超急性免疫排斥反应和血小板减少症是两个首要攻克难题。猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因(?-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)催化形成的αGal表位抗原,与人体天然存在的αGal表位抗体结合会引发超急性免疫排斥反应。表达于猪肝窦内皮细胞和Kuffer细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因。本研究利用基因组编辑技术转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-like(TAL)Effector Nucleases,TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略表
1 前言
    1.1 异种肝移植研究进展
    1.2 超急性免疫排斥反应
    1.3 血小板减少症
    1.4 基因组编辑技术
        1.4.1 ZFN技术
        1.4.2 TALEN技术
        1.4.3 CRISPR/Cas9技术
    1.5 本研究目的与意义
2 TALEN介导的GGTA1基因敲除猪制备
    2.1 实验材料
        2.1.1 动物性材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验耗材
        2.1.4 实验仪器设备
        2.1.5 实验溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 TALEN载体的构建
        2.2.2 体外转录TALEN mRNA
        2.2.3 转染、筛选及单细胞克隆鉴定
        2.2.4 GGTA1基因敲除仔猪鉴定
        2.2.5 脱靶分析
        2.2.6 流式细胞术检测仔猪α-Gal表位
        2.2.7 血清裂解实验
    2.3 结果与分析
        2.3.1 TALEN打靶载体的构建及基因突变效率检测
        2.3.2 阳性单细胞克隆鉴定
        2.3.3 基因敲除猪的鉴定
        2.3.4 脱靶分析
        2.3.5 GGTA1敲除猪α-Gal表位检测
        2.3.6 血清裂解反应
    2.4 讨论
3 CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备
    3.1 实验材料
        3.1.1 动物性材料
        3.1.2 质粒与菌株
        3.1.3 实验试剂及溶液配制
        3.1.4 实验耗材及主要仪器设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 CRISPR/Cas9打靶载体的设计及构建
        3.2.2 sgRNA基因突变效率检测
        3.2.3 转染、筛选及单细胞克隆鉴定
        3.2.4 基因敲除猪的鉴定
        3.2.5 脱靶效应分析
        3.2.6 Western Blot检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 sgRNA打靶载体的构建及基因突变效率检测
        3.3.2 阳性单细胞克隆鉴定
        3.3.3 敲除猪的鉴定
        3.3.4 脱靶分析
        3.3.5 Western blot检测
    3.4 讨论
4 全文结论
参考文献
致谢
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本文编号：3862602