Ezh2调控软骨发育及稳态维持的功能研究

发布时间：2024-04-26 04:49

　　骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是全世界影响最广泛的退行性慢性骨关节疾病,严重影响患者生活质量,并造成了巨大的社会经济成本。其特征在于关节软骨的退化导致的疼痛和功能受限。表观遗传(epigenetics)指在不改变DNA序列的情况下,通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和微小RNA(miRNA)等方式所进行的遗传学修饰。其中,EZH2(Enhancerof Zeste Homolog2)作为特异性的甲基化酶,使组蛋白H3上的27位赖氨酸发生三甲基化修饰,从而参与表观遗传学调控。已有越来越多的研究揭示了表观遗传学在骨关节炎的发生发展过程中扮演了重要角色。为探究骨骼发育与骨关节炎中Ezh2的影响与机制,我们进行了本课题的研究。在本研究中,我们利用GEO(GENEEXPRESSIONOMNIBUS)数据库,C57BL/6J小鼠的骨关节炎模型以及人OA样本,观察了Ezh2在骨关节炎软骨中的表达情况,并利用Col2a1-CreERr2;Ezh2f/f基因敲除系统小鼠行Ezh2条件性敲除,借以研究Ezh2软骨特异性敲除对胚胎与青春期骨软骨发育以及创伤性骨关节炎的影响。最后,通过对...

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【学位级别】：硕士

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致谢
中文摘要
Abstract
缩略词
绪论
第一章 软骨特异性敲除Ezh2对肢体发育的影响
    1.1 引言
    1.2 实验试剂与仪器
        1.2.1 材料和试剂
        1.2.2 相关染液的配制
    1.3 实验方法
        1.3.1 胚胎小鼠Ezh2软骨特异性敲除
        1.3.2 小鼠基因型鉴定
        1.3.3 全骨骼染色
        1.3.4 H&E染色
        1.3.5 统计学
        1.3.6 青春期小鼠Ezh2特异性敲除模型造模
        1.3.7 Safranin-O染色
        1.3.8 免疫组化
    1.4 实验结果
        Ezh2敲除对小鼠胚胎发育的影响
            1.4.1 胚胎期敲除Ezh2导致胚胎短缩畸形
            1.4.2 胚胎期敲除Ezh2导致胚胎长骨结构畸形
        Ezh2敲除对小鼠青春期发育的影响
            1.4.3 青春期敲除Ezh2导致关节软骨合成代谢增强
    1.5 讨论
第二章 EZH2在骨关节炎中的表达
    2.1 引言
    2.2 实验试剂与仪器
        2.2.1 材料和试剂
        2.2.2 相关染液的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 小鼠骨关节炎造模
        2.3.2 动物实验分组
        2.3.3 组织免疫荧光
        2.3.4 Western-blot
        2.3.5 关节炎患者软骨样本收集和确认
        2.3.6 Safranin-O染色
        2.3.7 人OA样本组织学评分
    2.4 实验结果
        2.4.1 EZH2在人与鼠骨关节炎软骨样本中表达上升
        2.4.2 人骨关节炎病患中存在EZH2阳性表达的亚群
    2.5 讨论
第三章 软骨特异性敲除Ezh2对创伤性骨关节炎进展的研究
    3.1 引言
    3.2 实验试剂与仪器
        3.2.1 材料和试剂
        3.2.2 相关染液的配置
    3.3 实验方法
        3.3.1 小鼠基因型鉴定
        3.3.2 实时荧光定量PCR(Real time PCR)
        3.3.3 Western-blot
        3.3.4 敲基因鼠骨关节炎造模
        3.3.5 Safranin-O染色
        3.3.6 OA的OARSI评分
        3.3.7 免疫荧光
        3.3.8 免疫组化
        3.3.9 敲基因鼠骨软骨缺损造模
        3.3.10 骨软骨损伤的ICRSII组织学评分
    3.4 实验结果
        3.4.1 在成年小鼠体内成功敲除EZH2
        3.4.2 软骨特异性敲除Ezh2加重骨关节炎进展
        3.4.3 Ezh2通过影响软骨细胞增殖与基质代谢影响骨关节炎发展
        3.4.4 Ezh2通过影响软骨基质合成影响骨软骨缺损修复
    3.5 讨论
第四章 Ezh2调节软骨损伤修复的机制研究
    4.1 引言
    4.2 实验试剂与仪器
        4.2.1 材料和试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 敲基因鼠原代软骨提取与培养
        4.3.2 体外基因敲除
        4.3.3 RNA-Seq
        4.3.4 Western-blot
        4.3.5 实时荧光定量PCR (Real time PCR)
        4.3.6 CCK-8测定细胞增殖曲线
        4.3.7 骨关节炎患者K-L评分
        4.3.8 划痕实验测定细胞损伤修复
    4.4 实验结果
        4.4.1 敲除Ezh2的原代软骨在TNF信号通路出现下调
        4.4.2 人骨关节炎Ezh2阳性亚群在TNFSF13B上具有差异性表达
        4.4.3 敲除Ezh2对细胞软骨肥大骨化相关标志物的影响
        4.4.4 Ezh2通过TNFSF13B促进细胞损伤修复
    4.5 讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
作者简历



本文编号：3964735