嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤小鼠小肠钙敏感通路影响的研究

发布时间：2017-05-26 14:14

  本文关键词：嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤小鼠小肠钙敏感通路影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：重型颅脑损伤(Severe head injury,SHI)所致的肠动力不足具有发生早、程度重、持续时间长的特点,其发生发展严重影响伤情转归及预后。肠动力不足不仅严重限制了早期肠内营养的顺利实施,而且若得不到有效改善后期容易导致营养不良、误吸、细菌移位甚至诱发MODS等严重并发症。促进胃肠功能的恢复能有效阻断MODS进一步发展,因此积极纠正重型颅脑损伤后肠动力不足有益于患者预后和疾病转归。肠道收缩的基本单位是平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC),其中20 kD肌球蛋白轻链(20 k D of myosin light chain,MLC20)是调控平滑肌收缩的重要结构域,其丝氨酸第19号位点与磷酸基团(Pi)结合后发生磷酸化,引起粗细肌丝间相对移位,拉动细胞发生收缩。基础研究表明,MLC20磷酸化过程受多重信号级联调控,钙依赖性通路/钙敏感通路是其中的两条主要途径,肌球蛋白轻链的磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)结构中活性亚基MYPT1(Myosin phosphatase target subunit 1)的磷酸化过程是钙敏感通路的核心环节,受到通路上游Rho相关激酶(Rho-associated kinase,ROCK)及Zipper相互作用蛋白激酶(Zipper-interacting protein kinase,ZIPK)等信号的联合调控,参与多种胃肠动力障碍疾病的发生发展,然而该通路是否与重型颅脑损伤后肠道动力不足有关,尚不清楚。目前临床针对重症患者出现的肠动力不足多采用药物治疗,但药物产生的副作用还会加重病情。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidphilus,La)可帮助改善功能性胃肠病、手术、感染等引起的胃肠动力不足,且作用温和。课题组前期发现,嗜酸乳杆菌可改善重型颅脑损伤后小鼠肠传输率,调节伤后小肠离体肌条收缩频率、幅度、张力的异常。结合前期研究和相关文献,我们推测:重型颅脑损伤可能导致肠道平滑肌细胞结构受损,钙敏感通路传导异常,进而出现肠道收缩的力量不足;La调节SHI后IMD的作用机制可能与修复伤后受损的平滑肌细胞结构,调节钙敏感通路中相关信号的传导有关。本课题旨在研究重型颅脑损伤所致肠动力不足产生的分子机制,选取嗜酸乳杆菌单菌进行干预,观测其对调节胃肠动力信号中钙敏感通路的影响,以进一步明确重型颅脑损伤对胃肠功能的影响以及嗜酸乳杆菌的作用机制,以期为该类益生菌在重症创伤领域的合理应用提供理论参考。一材料与方法1建立重型颅脑损伤致肠动力障碍小鼠模型将90只spf级雄性c57bl/6小鼠随机分为假伤组(对照组)、损伤组(shi+mrs组)、la组(shi+la组),各组又分别有1d、3d、7d三个时相点。采用方欢等改良的菲尼自由落体撞击法,建立重型颅脑损伤后肠动力障碍小鼠模型。对照的假伤组小鼠只打开颅骨不进行冲击致伤。假伤组和损伤组每日在相同时间点,灌胃0.5mlmrs(la专用)培养基,la组灌胃等体积la混悬液(含菌量≥1×1010cfu/d),各组其余时间均自由饮食水。2采用末端回肠组织he染色病理切片,观察小肠组织形态结构等基本病理变化,测算平滑肌肌层厚度。3采用特异性生物素标记的免疫组织化学染色法,检测mlc20、mlc20磷酸化、mlcp、mypt1亚基磷酸化信号表达与分布。4采用酶联免疫吸附测定法,检测小鼠回肠组织内mlcp表达量。5采用rt-pcr手段,检测rock、zipk激酶基因表达水平。二结果1.小肠组织病理及肌层厚度变化he染色结果显示,假伤组小肠全层组织结构完整,形态正常;shi组小鼠在1d、3d、7d时组织均出现明显病理变化,并且随时间进一步加重,出现肠黏膜上皮局灶性坏死,形成溃疡,肠黏膜屏障严重受损;肌层厚度明显变薄(vs.假伤组,1d,3dp0.05,7dp0.01)。嗜酸乳杆菌干预7d后小肠绒毛形态、高度、绒毛中段直径与假伤组无显著区别,间质无水肿及炎症反应,肌层未见明显病理改变,厚度正常。2.mlc20及其磷酸化水平变化免疫组化结果显示,mlc20的表达在三组间无明显差异。p-mlc20在shi后1d、3d、7d的水平均明显降低(vs.假伤组,p0.05);嗜酸乳杆菌干预1d、3d、7d后p-mlc20显著升高(vs.shi组,p0.05)。3.mlcp表达量与组织分布变化elisa结果显示,mlcp表达量在shi后1d、3d、7d的水平均显著升高(vs.假伤组,p0.01);嗜酸乳杆菌干预1d、3d、7d后p-mlc20明显降低(vs.shi组,p0.05)。免疫组化结果与elisa结果一致。4.p-mypt1组织分布变化免疫组化结果显示,p-mypt1组织分布在shi后1d、3d、7d均出现下降趋势(vs.假伤组,P0.01);嗜酸乳杆菌使用后使得1d、3d、7d的p-MYPT1表达升高(vs.SHI组,P0.01)。5.ROCK基因水平变化PCR结果显示,SHI后1d、3d、7d小肠组织ROCK基因表达均显著降低(vs.假伤组,P0.01)。使用嗜酸乳杆菌1d后ROCK基因的表达即显著升高(vs.SHI组,P0.05);干预3d和7d后均升高(vs.SHI组,P0.01)。6.ZIPK基因水平变化PCR结果显示,SHI后1d、3d、7d小肠组织ZIPK基因表达均显著降低(vs.假伤组,P0.01)。使用嗜酸乳杆菌1d和3d后ZIPK基因的表达升高(vs.SHI组,P0.05);干预7d后显著升高(vs.SHI组,P0.01)。并且在La组内,不同时间点具有统计学差异(P0.05)。三结论1.重型颅脑损伤后肠动力不足小鼠小肠组织呈现平滑肌肌细胞排列紊乱,细胞变性,胞核固缩,炎症细胞浸润和间质水肿的组织病理学改变;同时出现小肠平滑肌肌层变薄。2.重型颅脑损伤后肠动力不足小鼠小肠组织中MYPT1磷酸化水平下降,MLCP表达量和活性增加,肠道钙敏感通路异常激活,MLC20磷酸化水平下降;同时出现ROCK与ZIPK基因表达水平下降。3.嗜酸乳杆菌的干预使重型颅脑损伤后肠动力不足的小鼠小肠组织病理状态得到改善,平滑肌细胞受损程度减轻,肌层厚度增加。4.使用嗜酸乳杆菌后可以上调重型颅脑损伤后小肠ROCK与ZIPK基因水平;增加MYPT1的磷酸化,降低MLCP表达量和分布水平,抑制肠道钙敏感通路的过度激活,维持MLC20磷酸化水平。5.嗜酸乳杆菌调控重型颅脑损伤后肠动力不足的作用机理与调节ROCK和ZIPK介导的钙敏感通路有关。
【关键词】：重型颅脑损伤 嗜酸乳杆菌 肠动力不足 钙敏感通路
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 1.1 选题缘由13-14
• 1.2 研究背景14-15
• 1.3 研究目的15
• 1.4 研究内容15
• 1.5 研究方法15-16
• 1.6 技术路线16-17
• 第二章 嗜酸乳杆菌干预对重型颅脑损伤小鼠小肠组织病理变化的影响17-28
• 2.1 材料与方法17-21
• 2.2 结果21-24
• 2.3 讨论24-27
• 2.4 小结27-28
• 第三章 嗜酸乳杆菌干预对重型颅脑损伤小鼠小肠ROCK/MLCP通路的影响28-52
• 3.1 资料与方法28-36
• 3.2 结果36-47
• 3.3 讨论47-51
• 3.4 小结51-52
• 全文总结52
• 创新点52
• 不足之处52-53
• 参考文献53-60
• 文献综述 ROCK激酶与胃肠疾病的研究进展60-72
• 参考文献66-72
• 攻读硕士期间的研究成果72-73
• 致谢73

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本文编号：397081