GATA4招募PCG蛋白介导miR-29a表达调控C2C12细胞增殖与分化的机制研究

发布时间：2017-06-06 19:03

  本文关键词：GATA4招募PCG蛋白介导miR-29a表达调控C2C12细胞增殖与分化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是起源于骨骼肌的恶性肿瘤,也是儿童期最常见的软组织肿瘤,肌祖细胞增殖和分化失衡是其发生的主要原因,但相关分子机制,目前知之甚少,因此,阐明肌祖细胞增殖和分化的调控机制,对于揭示横纹肌肉瘤的发病机制具有重要意义。GATA家族是具有锌指结构的转录因子,能够结合靶基因启动子区域的WGATAA序列,从而调控基因的表达,其家族成员GATA4在调节成肌细胞C2C12的增殖和分化中起着重要作用,但在横纹肌肉瘤发生中的机制,目前尚未阐明。Polycomb复合体是一组抑制基因转录的蛋白,其复合体成员EZH2可通过对GATA4蛋白第299位赖氨酸甲基化从而抑制GATA4的转录活性。但二者在横纹肌肉瘤发生中的机制,目前尚未阐明。研究表明,micro RNA调节异常也与横纹肌肉瘤存在密切关系。micro RNA异常如肌肉特异性micro RNA(miR-1、miR-133a/b、miR-206)和miR-29家族异常,都会诱发横纹肌肉瘤的发生,但其精确机制,还有待于进一步阐明。本研究发现GATA4与EZH2通过调控miR-29a的表达,从而调控成肌细胞C2C12的增殖和分化,并在横纹肌肉瘤的发生中发挥作用。因此本课题旨在揭示C2C12的增殖和分化及横纹肌肉瘤发生的分子机制,以期为其治疗和预后评估提供理论依据。研究方法1.生物信息学软件预测,cyclin D2是miR-29a的下游靶基因,本研究中我们采用瞬时转染、MTT法、流式细胞分析、DAPI染色、荧光素酶报告基因、QPCR及Westem Blot实验来研究miR-29a靶向cyclin D2,对细胞增殖、周期和凋亡的影响。2.本研究中,我们采用稳定转染、QPCR、Westem Blotting、CO-IP和CHIP等实验方法,研究GATA4调控miR-29a的分子机制。实验结果1.MTT、流式细胞分析及DAPI染色结果表明,miR-29a引起细胞增殖抑制、周期阻滞和诱导凋亡。2.Luciferase结果显示,miR-29a能够与预测的cyclin D2 3’-UTR区域发生特异性结合,从而降低荧光素酶活性。3.Western Blotting和QPCR进一步证实了miR-29a可以在蛋白和m RNA水平下调cyclin D2的表达,表明miR-29a通过转录后沉默机制抑制了cyclin D2的表达,明确了cyclin D2确为miR-29a的靶基因。4.CHIP实验可知,GATA4招募PCG蛋白EZH2(PRC2),BMI1和RING1B(PRC1),H3K27me3富集于miR-29a的启动子区域,使其处于抑制状态。5.CO-IP实验进一步揭示GATA4与EZH2存在细胞内相互作用,这些结果初步阐明GATA4抑制miR-29a转录活性的内在分子机制。6.Western Blotting和QPCR证实,GATA4能够在m RNA水平抑制miR-29a,在蛋白和m RNA水平促进cyclin D2的表达。7.C2C12分化过程中的CHIP实验可知,GATA4与PCG蛋白不结合到miR-29a的启动子区域。结论1.miR-29a通过下调其下游靶基因cyclin D2的表达,抑制C2C12细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。2.在C2C12细胞中,GATA4通过招募Polycomb家族蛋白抑制miR-29a表达,上调cyclin D2表达,从而促进细胞增殖。3.在C2C12细胞分化过程中,GATA4与PCG蛋白不结合到miR-29a的启动子区域,对miR-29a表达的抑制作用消除,促进分化。
【关键词】：RMS GATA4 miR-29a cyclinD2 Polycomb
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.7
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文缩略词13-14
• 1 引言14-17
• 2 实验材料17-21
• 2.1 质粒、菌株与细胞系17
• 2.2 主要试剂17
• 2.3 主要溶液的配制17-21
• 3 实验方法21-36
• 3.1 稳定表达细胞系的建立21-22
• 3.1.1 C2C12细胞的培养21
• 3.1.2 脂质体转染21
• 3.1.3 G418筛选21-22
• 3.2 重组质粒的构建22-25
• 3.2.1 PCR扩增目的片段22
• 3.2.2 PCR产物胶回收22-23
• 3.2.3 PCR产物及载体的双酶切23
• 3.2.4 双酶切产物胶回收23
• 3.2.5 目的基因与载体的连接23-24
• 3.2.6 制备感受态细胞24
• 3.2.7 连接产物的转化24-25
• 3.2.8 挑单克隆25
• 3.2.9 小提质粒及酶切鉴定25
• 3.2.10 重组质粒的测序鉴定25
• 3.2.11 重组质粒的大量提取25
• 3.3 荧光素酶活性测定Lμciferase25-26
• 3.4 细胞增殖实验26
• 3.5 流式细胞术（PI单染测细胞周期）26-27
• 3.6 DAPI染色27
• 3.7 RNA提取与反转录27-30
• 3.7.1 细胞中总RNA的提取27-28
• 3.7.2 Oligo(d T)引物反转录28
• 3.7.3 茎环引物法反转录28-29
• 3.7.4 QPCR29-30
• 3.8 免疫共沉淀（CO-IP）与Western Blotting30-33
• 3.8.1 细胞核蛋白的提取30
• 3.8.2 Bradford法测定蛋白浓度30
• 3.8.3 免疫共沉淀（CO-IP）30-31
• 3.8.4 蛋白免疫印迹实验Western Blotting31-33
• 3.9 染色质免疫共沉淀（CHIP）33-35
• 3.9.1 准备CHIP样品33-35
• 3.9.2 CHIP-QPCR35
• 3.10 统计学分析35-36
• 4 实验结果36-50
• 4.1 miR-29a靶向cyclin D2调控细胞增殖、周期及凋亡36-43
• 4.1.1 miR-29a对细胞增殖的影响36-38
• 4.1.2 miR-29a对细胞周期的影响38-39
• 4.1.3 miR-29a对细胞核形态的影响39
• 4.1.4 利用生物信息学软件预测miR-29a打靶的下游靶基因39-40
• 4.1.5 miR-29a与cyclin D23’-UTR结合40-41
• 4.1.6 miR-29a对cyclin D2蛋白及m RNA水平的影响41-43
• 4.2 GATA4招募PCG蛋白下调miR-29a表达，上调cyclin D2表达43-48
• 4.2.1 GATA4对miR-29a m RNA表达水平的影响43-44
• 4.2.2 GATA4与PCG蛋白在细胞内相互作用44-45
• 4.2.3 GATA4将Polycomb家族蛋白招募到miR-29a的启动子区域45-47
• 4.2.4 GATA4对cyclin D2蛋白及m RNA表达水平的影响47-48
• 4.3 C2C12分化过程中，，GATA4与PCG蛋白不结合到miR-29a的启动子上48-50
• 5 讨论50-54
• 6 结论54-55
• 7 参考文献55-60
• 8 文献综述 miR-29 家族的角色：调节、功能及信号60-77
• 简介60-61
• 8.1 miR-29 及其调控61-62
• 8.2 miR-29 作为肿瘤抑制因子62-67
• 8.2.1 miR-29 的表观遗传调控作用62-64
• 8.2.2 miR-29 在细胞增殖、细胞凋亡和分化中的作用64-65
• 8.2.3 miR-29 在癌细胞转移和侵袭中的作用65-66
• 8.2.4 miR-29 和癌症的化学敏感性66-67
• 8.3 miR-29 作为肿瘤促进剂的功能67-68
• 8.4 miR-29 的靶基因68-69
• 8.5 miR-29 调控的信号通路69-70
• 8.6 结论和未来的发展方向70-71
• 参考文献71-77
• 个人简历及在学期间发表的学术论文77-78
• 致谢78

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