张力负荷下CC复合体介导的RhoA信号通路对大鼠终板软骨细胞退变的影响与作用

发布时间：2017-07-01 04:17

  本文关键词：张力负荷下CC复合体介导的RhoA信号通路对大鼠终板软骨细胞退变的影响与作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:在体外建立大鼠终板软骨细胞张力诱导退变模型,研究P-120catenin蛋白与RhoA/ROCK-1信号通路在体外张力诱导下终板软骨细胞退变相互作用。方法:无菌条件下操作处理并分离大鼠腰椎部位终板软骨,利用胶原酶以及胰酶提取终板软骨细胞,培养并采用第二代终板软骨细胞,采用FX-5000仪器施加牵张力建立终板软骨细胞体外张力载荷模型;利用LIVE/DEAD染色方法以及流式细胞学检测细胞的存活率和细胞凋亡;通过鬼笔环肽染色来对终板软骨细胞的细胞骨架变化进行检测;采用组织学染色方法检测脊柱组织以及终板软骨细胞的细胞外基质退变表达;同时通过RhoA/ROCK-1信号通路抑制剂以及过表达E-cadherin、P120-catenin质粒转染对实验进行调控检测来抑制各个信号及蛋白基因的表达,来观察其对终板软骨细胞的影响;利用免疫共沉淀技术分析检测E-cadherin和P120-catenin、P120-catenin和RhoA之间的相互偶联作用;通过Realtime RT-PCR和Western blot检测张力加载前后以及施加调控后的软骨标志基因二型胶原、SOX-9、蛋白聚糖的基因和蛋白表达进行检测;免疫荧光检测各个蛋白在终板软骨细胞中的定位和表达;结果:通过张力加载后,终板软骨细胞中相关基因二型胶原、Sox9基因及蛋白聚糖的表达随着加力的延长逐渐下调,软骨细胞细胞外基质的合成受到明显抑制。同时牵张力刺激能够改变终板软骨细胞的细胞骨架发生明显改变,而终板软骨细胞的凋亡则未见差异。随着张力加载的作用下,终板软骨细胞中RhoA/ROCK-1的基因与蛋白的表达明显增高;抑制RhoA/ROCK-1信号通路后相关基因及蛋白表达降低,而终板软骨细胞的退变明显减轻。张力载荷作用下终板软骨细胞中P120-catenin基因及蛋白水平均明显降低,同时P120-catenin与E-cadherin蛋白之间的相互结合作用明显降低;过表达P120-catenin蛋白后,软骨细胞中P120-catenin基因表达显著增高,E-cadherin的表达也明显升高,P120-catenin和E-cadherin之间的相互结合作用也明显升高,RhoA/ROCK-1信号通路相关蛋白表达则有显著降低,而张力作用下的终板软骨细胞退变状况也明显减轻。结论:张力载荷作用下通过激活RhoA/ROCK-1信号通路使终板软骨细胞发生退变;同时,张力刺激还可通过抑制P120-catenin和E-cadherin之间的偶联表达作用,使终板软骨细胞退变加重。调控RhoA/ROCK-1信号通路及P120-catenin的表达能够减轻终板软骨的退变。
【关键词】：间歇性循环张力 终板软骨细胞 RhoA/ROCK-1信号通路 P120-catenin 退变
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R681.5
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-14
• 材料（资料、内容）与方法14-35
• 1. 研究内容14-16
• 1.1 在体外建立大鼠终板软骨细胞牵张力诱导模型15
• 1.2 观察张力诱导前后终板软骨细胞软骨表型及生物学表型的改变15
• 1.3 观察在牵张力诱导下RhoA/ROCK-1 信号通路在终板软骨细胞中的表达和意义15
• 1.4 观察在利用RhoA/ROCK-1 信号通路抑制剂时对牵张力下终板软骨细胞退变的影响15-16
• 1.5 牵张力诱导前后终板软骨细胞中P120-catenin及E-cadherin的表达及相互作用16
• 1.6 过表达P120-catenin及E-cadherin对牵张力加载前后RhoA/ROCK-1信号通路以及对终板软骨细胞退变的影响16
• 2. 材料与方法16-34
• 2.1 实验动物16
• 2.2 主要试剂及仪器16-19
• 2.3 建立体外大鼠终板软骨细胞牵张力加载模型19-22
• 2.4 施加牵张力前后终板软骨细胞活力、凋亡、细胞骨架的检测22-23
• 2.5 细胞及椎间盘组织染色实验23-25
• 2.6 RT-PCR法检测终板软骨细胞m RNA的表达25-27
• 2.7 Western blot法 （ 蛋白印记 ） 测定蛋白的表达27-30
• 2.8 RhoA的活性检测30
• 2.9 免疫荧光及激光共聚焦检测30-31
• 2.10 免疫共沉淀分子实验31-32
• 2.11 过表达质粒构建实验32-34
• 3 统计学处理34-35
• 本实验技术路线图35
• 结果35-45
• 讨论45-50
• 结论50-51
• 参考文献51-58
• 综述58-64
• 参考文献62-64
• 附录64-66
• 作者简介及读研期间主要科研成果66-67
• 致谢67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈露;吴小涛;王运涛;;椎间盘退变生物学治疗研究进展[J];东南大学学报(医学版);2013年04期

2 徐宏光;陈小虎;王弘;王凌挺;陈学武;;兔椎体软骨终板血管芽增龄性变化[J];中华骨科杂志;2011年04期

  本文关键词：张力负荷下CC复合体介导的RhoA信号通路对大鼠终板软骨细胞退变的影响与作用，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：504555