氯离子通道蛋白CLICs及其突变体与Sedlin相互作用的初步研究

发布时间：2017-07-27 05:01

  本文关键词：氯离子通道蛋白CLICs及其突变体与Sedlin相互作用的初步研究

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【摘要】：目的为了研究胞内氯离子通道蛋白CLICs及其突变体与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白Sedlin的相互作用,运用分子克隆技术构建下游为FLAG标签的CLICs及其突变体的真核表达质粒。通过瞬时转染,免疫荧光实验,免疫印迹和GST pulldown实验等研究蛋白质的共定位及相互作用情况,探索CLIC家族的生物学功能。方法以pc DNA3-CLIC1-FLAG重组质粒为模板,运用分子克隆技术构建真核表达质粒pc DNA3-CLIC1(C24A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(C59A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(△49-51)-FLAG;以CLIC2全长c DNA序列为模板,构建真核表达质粒pc DNA3-CLIC2-FLAG、pc DNA3-CLIC2(C30A)-FLAG;以pc DNA3-CLIC3-FLAG重组质粒为模板,构建真核表达质粒pc DNA3-CLIC3(C22A)-FLAG;以pc DNA3-CLIC4-FLAG重组质粒为模板,构建真核表达质粒pc DNA3-CLIC4(C35A)-FLAG;以CLIC5全长c DNA序列为模板,构建真核表达质粒pc DNA3-CLIC5(C32A)-FLAG。将真核表达质粒单转染入COS7细胞,观察其细胞定位,再将CLICs及其突变体真核表达质粒与p CDGFP-Sedlin共同转染入COS7细胞中,用激光共聚焦荧光显微镜观察两种蛋白在细胞内的共定位情况;将CLICs全长及其突变体转染入HEK 293T细胞中,提取细胞总蛋白,利用Western blot法检测蛋白表达情况;p GEX-5X-3-SEDL转化到BL21感受态细胞中,制备融合蛋白,同时分别转染CLICs全长及其突变体真核表达质粒到HEK293T细胞中,通过GST pulldown技术检测其在体外相互作用情况。结果酶切鉴定和测序结果表明成功构建了实验相关的重组质粒及突变体;Western blotting结果显示CLIC1及其三个点突变体蛋白在HEK 293T细胞中均能表达,CLIC2、CLIC3及CLIC4同样均能表达;免疫荧光实验表明,CLIC1主要定位在细胞核,胞质也有表达;CLIC1点突变体蛋白定位在胞质中,细胞核中无分布;CLIC1缺失突变体蛋白定位在胞质中,核有少量表达;CLIC2在细胞核及胞质均有定位;CLIC2点突变体蛋白定位发生明显变化,有少量荧光且呈现点状分布;CLIC3、CLIC4主要定位在胞质中,细胞核有少量分布;CLIC5蛋白定位在胞质中,细胞核中无分布;CLIC3点突变体蛋白定位在胞质中,核有少量表达;CLIC4点突变体蛋白定位在胞质中,细胞核有少量分布;CLIC5点突变体蛋白主要定位在胞质中,细胞核无分布;CLIC1、CLIC2与Sedlin蛋白在胞质、胞核均有共定位;CLIC1点突变体与Sedlin蛋白只在胞质存在共定位;CLIC2点突变体与Sedlin蛋白不存在共定位;CLIC3与Sedlin蛋白在胞质存在共定位;CLIC3点突变体与Sedlin蛋白在胞质存在共定位。GST pulldown实验表明野生型CLICs蛋白都和Sedlin蛋白存在相互作用,证明CLIC1点突变体与GST-Sedlin蛋白之间没有互作关系。结论CLIC1及其点突变体、CLIC2、CLIC3及其点突变体与Sedlin蛋白均存在共定位;CLIC1及其三种点突变体,CLIC(2-4)均能在哺乳动物细胞中有效表达并且野生型CLIC(1-5)都和Sedlin蛋白存在相互作用,但CLIC1点突变体与后者不存在相互作用,为进一步揭示CLICs蛋白的功能奠定了基础,对CLIC家族有了初步认识。
【关键词】：CLICs 免疫荧光 Western blotting 免疫共沉淀 相互作用
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R681.1;Q78
【目录】：

• 英文缩写词一览表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料与方法13-37
• 3 实验结果37-52
• 4 讨论52-54
• 5 结论54-55
• 6 对本课题的展望55-56
• 7 参考文献56-60
• 附录60-61
• 致谢61-62
• 综述62-74
• 参考文献70-74

【参考文献】

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2 宋波,唐建武,王波,崔晓楠,周春辉,侯力;基因芯片筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关基因[J];癌症;2005年07期

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本文编号：579836