压力对小鼠成骨细胞增殖活性影响的基因表达谱差异分析

发布时间：2017-08-04 21:39

  本文关键词：压力对小鼠成骨细胞增殖活性影响的基因表达谱差异分析

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【摘要】：目的:在整个生长发育的过程中,机械力刺激无时无刻不在对机体产生着巨大的作用,尤其体现在骨骼发育、骨折愈合、骨改建等方面。在骨形成过程中,成骨细胞起着至关重要的作用,且对外界力学刺激敏感。以往学者认为,压力能促进骨的吸收,不利于骨的形成。然而近年来,越来越多的研究表明,适合的压力可能会促进成骨细胞的增殖分化,进而对骨的形成起一定促进作用,但目前的研究对成骨细胞受到力学刺激后细胞内生物力学信号的转导机制尚不明确。本实验通过体外培养小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1形成3D细胞薄膜,利用FX-5000C压力加载系统对其施加10%压缩率,MTT法检测压力对小鼠成骨细胞增殖活性的作用,并利用Affymetrix基因表达谱芯片技术,分析压力对小鼠成骨细胞差异基因表达的影响,探讨压力对成骨细胞的作用机制,为临床研究骨改建的机理以及相关疾病的治疗和恢复提供理论依据和实验参考。方法:1小鼠成骨细胞MC3T3-E1体外培养复苏冻存的原代小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1,镜下观察细胞生长情况,待细胞长满瓶底,且生长状况良好时进行细胞传代。选取状态良好、呈对数期生长的MC3T3-E1细胞,制备成单细胞悬液,以1×105细胞/孔接种到12培养孔板上,培养28天,形成一层厚度约1~2 mm的3D细胞薄膜备用。2小鼠成骨细胞体外加载模型的建立收集3D细胞薄膜,滴入到6个6孔压力培养板中,将6个6孔压力培养板随机分为实验组1小时(A1组)、4小时(B1组)、8小时(C1组),对照组1小时(A2组)、4小时(B2组)、8小时(C2组)。利用FX-5000C细胞压力加载系统对实验组施加频率为1 Hz(正弦波形),10%的压缩率,分别加压1、4、8小时,对照组不加力,同样条件下培养1、4、8小时。3小鼠成骨细胞增殖活性的检测加力结束后,使用MTT法检测各组细胞的增殖情况,用酶联免疫检测仪在490 nm处检测各组细胞的吸光度值(optical density,OD值),记录数据,并使用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。4小鼠成骨细胞总RNA的提取选取增殖活性最强的实验组和相应对照组的细胞,使用TRIZOL法提取细胞的总RNA,测定RNA的纯度、浓度及完整性。5小鼠成骨细胞基因芯片的制备及检测将提取的总RNA标本制备全基因组表达谱芯片,继而进行芯片的洗染和扫描,对得出数据进行检测并用Transcriptome Analysis Console 3.0分析软件对结果进行分析,筛选差异基因。结果:1细胞增殖活性MTT实验结果对成骨细胞加压1、4、8小时后,各实验组与相应对照组吸光度均值(以x±SD表示),A1组:0.323±0.047,A2组:0.307±0.034;B1组:0.850±0.060,B2组:0.313±0.027;C1组:0.530±0.081,C2组:0.307±0.025;A1组与A2组吸光度值比较无统计学差异(P0.05);B1组与B2组吸光度值比较有统计学差异(P0.001);C1组与C2组吸光度值比较有统计学差异(P0.001);三个对照组细胞吸光度值无统计学差异(P0.05);三个实验组细胞吸光度值比较有统计学差异(P0.05)。MTT结果表明:加力1小时时,实验组与对照组成骨细胞的增殖活性没有显著差异;加力4小时时,成骨细胞的增殖活性达到高峰,随着加力时间的延长,细胞的增殖活性逐渐降低。2总RNA的浓度、纯度及完整性检测利用Nanodrop 2000/2000 C分光光度计测定结果显示:B1组(加力4小时组)与B2组(4小时对照组)总RNA的OD260/OD280比值均位于1.8~2.0之间,纯度及浓度符合实验要求。凝胶电泳结果显示:B1组(加力4小时组)与B2组(4小时对照组)RNA经琼脂糖凝胶电泳后利用全自动凝胶成像系统(GBOXF3)分析,可见三个条带出现,28 S条带亮度约为18 S条带亮度的两倍,5 S条带较淡,说明各组提取的总RNA完整性良好,符合实验要求。3小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1全基因组m RNA表达谱差异分析在所分析的34472条小鼠全组基因中,筛选出基因信号上调和下调2倍及以上差异的全部基因,B1组(加力4小时组)与B2组(4小时对照组)成骨细胞之间差异表达显著的基因共出现3609条,其中上调的基因有1657条,下调的基因有1952条,这些基因的产物涉及细胞信号转导、增殖、分化、凋亡等多个方面。结论:1对成骨细胞施加适当的压力及时间,能增强成骨细胞的增殖活性。2压力下成骨细胞基因表达谱发生改变,Myc、Jun、Fos、Runx2、Wnt10b、Lrp5等成骨相关基因显著上调。3 Myc、Jun、Fos、Runx2、Wnt10b、Lrp5等成骨相关基因可能主要通过TGF-β信号通路和Wnt信号通路来促进成骨细胞的增殖分化。
【关键词】：成骨细胞 压力 增殖活性 基因芯片 3D细胞薄膜
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-24
• 结果24-26
• 附图26-32
• 附表32-54
• 讨论54-58
• 结论58-59
• 参考文献59-61
• 综述 压力对成骨细胞增殖分化影响的研究现状61-70
• 参考文献67-70
• 致谢70-71
• 个人简历71

【参考文献】

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3 毛勇,段小红,王忠义,张玉梅;不同应力对成骨细胞和细胞骨架影响的实验研究[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2001年02期

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本文编号：621874