TAp73、Beclin1在人骨肉瘤中表达及其临床意义

发布时间：2017-08-06 23:12

  本文关键词：TAp73、Beclin1在人骨肉瘤中表达及其临床意义

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【摘要】：背景和目的：骨肉瘤是最常见的原发与骨组织的恶性肿瘤,主要的患病人群是儿童、青少年,致残致死率非常高,目前临床主要采用的治疗手段是手术联合新辅助化疗。但是根据近30年来的国内外相关文献的报道,骨肉瘤患者的总体疗效没有显著提高,总体生存率为60%左右,而且仍存在着较高的术后肿瘤复发、转移,很多患者是因为术后肿瘤的转移而死亡,大部分是肺转移。导致目前这种尴尬的情况主要原因是骨肉瘤对目前传统的化疗药物耐药,术后化疗效果差,患者预后不理想。因此,开辟新的治疗途径,提高疗效成为骨肉瘤研究的热点。近年的研究发现：自噬与肿瘤的发生、发展关系十分密切：自噬参与了肿瘤细胞的凋亡、耐药、耐受放疗和肿瘤干细胞分化增殖的调节。而且,有学者发现自噬对于骨肉瘤的生长和耐药存在调节作用。但是,具体自噬是如何调节骨肉瘤的生长发展?如何参与肿瘤化疗的耐药?目前关于这些调节机制仍无的权威文献做出具体的报道。所以我们课题组认为通过研究骨肉瘤细胞的自噬调节机制,阐明白噬对恶性肿瘤生长、耐药的机制。然后通过调节细胞自噬抑制骨肉瘤的生长、促进化疗的敏感性,可能是提高骨肉瘤化疗的一个途径。自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬一般是在机体应激的情况下被激活,比如：细胞饥饿、缺氧、炎症等,被认为是细胞一种至关重要的生存机制,维持细胞的稳态。自噬虽然是一种细胞的保护机制,维持细胞的稳态,而过度激活自噬可以导致细胞自噬性死亡,称为Ⅱ型细胞程序性死亡。自噬在机体的生理和病理过程中都能看到,自噬与肿瘤的关系密切,自噬对肿瘤的作用是双向的,既有促进肿瘤的生长,同时也可以抑制肿瘤的生长,其具体的调控机制尚未被完全阐明。有学者认为：自噬具有促进肿瘤的生长、诱导耐药和抗放疗作用,而且已有一些自噬调节剂应用于肿瘤的临床试验研究,并取得良好的效果。但是,进一步的研究后发现：虽然自噬可以促进某些肿瘤组织的发生、生长、耐药、抗放疗,当在另一些肿瘤组织中自噬不但没有促进肿瘤的作用,甚至出现抑制肿瘤生长、发展的作用。近年来在骨肉瘤的研究中也发现自噬对骨肉瘤具有调节作用,但是对于其如何发挥作用的机制尚未有具体的研究进行报道。探索自噬对骨肉瘤的调节作用,寻找一种通过调节自噬来治疗骨肉瘤的精准途径是下一步研究的目的。研究发现：p53参与肿瘤细胞自噬的调节。Rosenfeldt等在Nature和New England J Med上发表的论文认为,自噬在p53野生型的肿瘤细胞中有促进肿瘤生长的作用,而在p53突变的肿瘤细胞中,自噬调节却是一种肿瘤的抑制机制。Rao等、Mansilla等和Chakradeo等也发现：p53是调节自噬的关键因子,在p53缺失的肿瘤细胞中,自噬可以增加蒽环类抗癌药物的疗效。P53是人类重要的抗瘤基因,但是p53基因在恶性肿瘤中普遍发生突变或者缺失。P53基因的突变或缺失是骨肉瘤的一个重要的遗传标记。在肿瘤细胞和动物实验中发现：在p53基因缺失的肿瘤中,转染重组野生型p53基因可以抑制肿瘤的生长和耐药,但是目前人体内基因治疗在转染效率、稳定性、特异性、载体的安全性等方面仍存在很多问题,这种基因治疗策略还很难运用到临床当中。P73是p53家族的新成员,也被大多学者认为能够解决上述问题的p53最理想替代者。P73基因定位于人类1号染色体1p36,而在人类多种肿瘤研究中发现,该区域基因缺失是多数肿瘤共性。然而,1p36又是人类多个抑癌基因存在的区域。因为p73基因定位的特殊性及其与p53基因结构和功能存在高度的同源性,所以p73基因被广大的研究学者认为是一个新的抑癌基因。P73蛋白普遍存在于真核细胞中,它参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞生长、分化与衰老、神经发育等过程。在很多肿瘤中p73参与肿瘤耐药、抗放疗等,能够调节肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高药物的化疗效果等。另外,p73是与DRAM关系密切,也可以通过激活DRAM调节自噬。甚至,在有些文献的报道中,p73能够直接调节自噬相关因子,包括Atg5及Atg7。TAp73是p73全长亚型,具有与野生型p53非常相似的结构和抗肿瘤功能。TAp73可以促进骨肉瘤分化,抑制肿瘤恶变,特异性激活TAp73功能可以提高肿瘤对化疗、放疗的敏感性。而且已有相关研究认为TAp73基因参与肿瘤自噬的调节,但是其具体的作用机制尚且没有完全被阐明。最为关键的是,与p53相比,TAp73表达非常稳定,很少发生突变。有研究发现：在p53基因缺失的肿瘤细胞中特异性激活TAp73的功能,可以激活p53基因下游某些信号通路,从而抑制肿瘤的生长、发展,进而促进肿瘤凋亡。自噬通过抑制p53基因家族下游的信号通路达到对肿瘤的调节作用,而TAp73也参与p53基因家族抗肿瘤信号通路的调节。因此,TAp73跟肿瘤自噬之间是否存在一些联系?研究TAp73与肿瘤自噬相关基因在人骨肉瘤中表达的关系可以为此解开TAp73和肿瘤自噬关系的神秘面纱,有助于进一步探索TAp73调节肿瘤自噬的具体机制,为下一步深入研究提供基础。自噬相关因子Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因,也称为BECN1,在肿瘤细胞自噬过程中发挥非常重要的作用。1998年,Liang等人在致死性Sinbis病毒性脑炎的大鼠中发现一种分子量为60kDa的蛋白质,与bcl-2的基因产物bcl-2相互作用,并能抑制sinbis病毒的复制,他们将这种蛋白质的基因命名为Beclin1。Beclin1基因位于人染色体17q21,含有12个外子,Beclin1蛋白含有3个结构域(BH3,CCD,ECD),这些结构域是Beclin1与其他蛋白相互作用的部位。Beclin1是自噬体形成一个必需分子,它能够介导其他自噬蛋白定位于自噬吞噬泡,从而调控哺乳动物自噬体的形成和成熟。在自噬过程中Beclin1表达水平往往是呈上升状态。Beclin1的过表达可以使得磷脂酰肌醇3激酶家族Ⅲ表达上调,而PI3KC1(p110α)及其下游的p-PKB表达下调,进而诱导肿瘤细胞自噬活性的增加,抑制肿瘤细胞的增殖和生长,产生抑癌效应。Beclin1是肿瘤自噬调节中最主要的分子之一,它能够通过不同的调节机制调节肿瘤自噬的活性,也就是说Beclin1在肿瘤中的表达是自噬活性的一种体现,可以通过检测Beclin1的表达情况描述肿瘤的自噬活性。Beclin1在临床上很多肿瘤中的表达已经有大量的文献的,但是在人骨肉瘤中表达及其具体的调节尚未有具体的文献做出详细报道及阐述。本研究设计的优势：①TAp73属于p53抗肿瘤基因家族。P53突变或缺失是骨肉瘤发生发展以及诱导肿瘤细胞耐药的原因之一,同时,p53也是骨肉瘤的一个治疗靶点。本研究通过探讨TAp73与肿瘤自噬调节的关系,试图寻找一种通过调节自噬治疗骨肉瘤的精确途径。②研究对象TAp73表达稳定,不易发生突变,又与wt-p53结构和抗肿瘤功能高度相似。以TAp73为切入点,通过探索其与细胞自噬的关系,不但可以调节TAp73的稳定性及蛋白含量,激活其特异性功能,而且还可以调节细胞自噬活性,最终达到对肿瘤生长的抑制作用。③本课题的结果为下一步继续探讨TAp73调节自噬的机制提供研究基础。本研究拟解决的问题：(1)TAp73、Beclin1蛋白在人骨肉瘤中表达是否对患者的预后产生影响?(2)在人骨肉瘤中TAp73蛋白表达是否对Beclin1蛋白表达是否存在某一种联系?(3)在人骨肉瘤中TAp73和Beclin1蛋白两者表达的相关性如何?围绕上述几个问题,本实验利用免疫组化检测TAp73、Beclin1在人骨肉瘤中的表达情况,结合骨肉瘤患者的临床资料,运用统计学方法进行分析,探讨TAp73与细胞自噬的关系以及自噬在骨肉瘤中的作用,为临床应用提供实验依据。方法：临床收集48例骨肉瘤患者病例,采用定期采用电话或者预约回本院门诊复诊方式对患者进行随访,并且详细记录所有骨肉瘤患者的病情进展情况。通过免疫组化的方法将各个患者的病理标本进行切片观察后,记录TAp73、Beclin1的表达情况。结合患者的临床资料,分析TAp73、Beclin1表达在性别、转移、5年生存率的差异,并且利用统计学方法分析两者在人骨肉瘤中表达的相关性。结果：1.TAp73、Beclin1阳性表达均有助于患者的预后在人骨肉瘤中,TAp73、Beclin1阳性表达与患者的生存时间呈正相关(r=0.673,P=0.000;r=0.388,P=0.003),TAp73、Beclin1阳性表达的患者的总体生存率优于TAp73、Beclin1阴性表达的患者(80.8%vs50.0%,P=0.000; 80.0%vs44.4%,P=0.001),且TAp73、Beclin1的表达程度越高,患者的预后越好。综合结果发现,TAp73阳性表达能够抑制肿瘤恶变,提高骨肉瘤的化疗敏感性,有助于患者的预后；自噬活性上调有助于抑制骨肉瘤发展,诱导骨肉瘤细胞自噬死亡,自噬对骨肉瘤的调节是一种肿瘤抑制机制。2.TAp73促进Beclin1蛋白的表达在人骨肉瘤中TAp73蛋白的阳性表达与阴性表达,其Beclin1蛋白的表达程度不同(28.3519.95；Z=-2.146,P=0.032),两种蛋白表达程度呈正相关(r=0.470,P=0.001)。结果分析：TAp73促进Beclin1蛋白的表达,即TAp73存在上调自噬活性的功能。所有的实验数据均采用SPSS20.0统计软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差表示,率之间的比较均采用x2分析,相关性分析均采用Spearman相关检验、Kaplan-Meier法计算本研究中所有患者总体生存率,生存率的比较采用Log-rank检验。P0.05视为差异有统计学意义。结论：1.骨肉瘤患者肿瘤组织中TAp73、Beclin1蛋白阳性表达,可以抑制肿瘤的发展,有助于提高患者的总体生存率；2.骨肉瘤中TAp73、Beclin1的表达与患者的生存时间呈正相关,表达程度越高,骨肉瘤患者的预后越好。3.在临床工作中,检测骨肉瘤患者TAp73、Beclin1蛋白的表达,有助于对患者的预后的评估,协助临床医生调整术后的化疗方案；4.在骨肉瘤中TAp73的阳性表达,可以促进Beclin1蛋白表达,上调骨肉瘤细胞的自噬活性；5.TAp73是否能够成为通过调节肿瘤自噬活性治疗骨肉瘤新的治疗靶点,需要进一步探讨TAp73调节自噬的具体机制。
【关键词】：人骨肉瘤 自噬 TAp73 Beclin1 预后
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 前言19-26
• 第1节 研究背景19-24
• 第2节 研究目的、意义及内容24-26
• 第二章 实验部分26-54
• 第1节 资料与方法26-33
• 1.1 一般资料26-28
• 1.2 实验设计28
• 1.3 实验方法28-32
• 1.4 评分标准32-33
• 1.5 统计方法33
• 第2节 结果33-43
• 2.1 TAp73在骨肉瘤组织中的表达及患者的总体生存率情况33-37
• 2.2 Beclin1在骨肉瘤组织中的表达及患者的总体生存率情况37-41
• 2.3 TAp73阳性表达与Beclin1表达程度的关系41-42
• 2.4 在人骨肉瘤中TAp73和Beclin1表达程度的关系42-43
• 第3节 讨论43-54
• 参考文献54-66
• 全文总结66-67
• 实验不足与展望67-68
• 中英文缩略词对照表68-69
• 攻读学位期间成果69-70
• 致谢70-72

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2 杨小玉;顾锐;高忠礼;隋福革;孙伟;殷昭阳;张善永;;人骨肉瘤蛋白质组双向凝胶电泳图像分析方法的建立与应用[J];吉林大学学报(医学版);2007年06期

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本文编号：631844