17-β雌二醇抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的作用机制研究

发布时间：2017-08-07 16:22

  本文关键词：17-β雌二醇抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的作用机制研究

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【摘要】：目的:采用白细胞介素1β(interleukin-1βIL-1β)建立软骨细胞凋亡模型,研究17-β雌二醇在其中的作用机制。方法:体外分离培养鼠关节软骨细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,甲苯胺蓝染色及II胶原蛋白免疫组化染色鉴定原代培养细胞为软骨细胞。实验分为对照组、IL-1β作用组、系列浓度的17-β雌二醇组(系列浓度的17-β雌二醇+50ng/mlrr IL-1β)及雌激素受体阻滞剂组(17-β雌二醇+ICI182780+50ng/mlrr IL-1β),CCK-8发测定细胞存活率,配制不同浓度17-β雌二醇,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测不同浓度17-β雌二醇对软骨细胞增殖的影响。Annexin V-FITC/PI荧光染色观察各组细胞凋亡,采用RT-PCR方法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、MMP3及MMP13m RNA表达水平;Western blotting方法检测MMP3、MMP13蛋白的表达水平结果:分离培养的SD大鼠软骨细胞在倒置相差显微镜下观察大多呈多角形,具有丰富的胞质,细胞核位于胞体中心,少数可有多个核仁,原代软骨细胞培养10天左右达到融合状态。正常软骨细胞经甲苯胺蓝染色能使细胞胞浆呈蓝色,细胞核呈紫蓝色,大多数为圆形或椭圆形,可见多个核仁。CCK-8检测结果发现:与对照组相比,IL-1β组仅有约40%的生存率,细胞明显减少。与IL-1β组相比,17β-E2+IL-1β组细胞存活率显著增加,并呈剂量依赖性。IL-1β组和17β-E2+IL-1β+ICI组之间细胞存活率没有明显变化。通过Annexin V-FITC和PI双标荧光染色显示IL-1β诱导组软骨细胞凋亡比例较3组不同浓度17β-E2(10-7 M,10-9M,10-11M)+IL-1β组均高。17β-E2+IL-1β+ICI组与IL-1β诱导组相比无显著差别。RT-PCR方法检测凋亡相关基因,与对照组比较,IL-1β诱导后,细胞Bax表达升高,Bcl-2表达降低,差异具有统计学意义。3组浓度的17β-E2均具有抑制IL-1β上调Bax表达的作用,与IL-1β组和17β-E2+IL-1β+ICI组比较差异均具有统计学意义。Western blotting检测发现B组细胞的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明显大于A和C组(P0.05),并且D组的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明显大于A和C组(P0.05)。结论:(1)IL-1β能成功诱导关节软骨细胞凋亡,可以用来模拟体内骨关节炎软骨损害的体外模型(2)17-β雌二醇能抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,并且抑制效果成剂量依赖性。(3)17-β雌二醇是通过下调MMP-3、MMP-13的表达抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。
【关键词】：软骨细胞 细胞凋亡 骨性关节炎 雌激素 白细胞介素-1β 基质金属蛋白酶
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-25
• 2.1 实验材料13-17
• 2.1.1 细胞来源13
• 2.1.2 主要试剂及耗材13-14
• 2.1.3 主要仪器14
• 2.1.4 主要试剂配制14-17
• 2.2 实验方法17-24
• 2.2.1 器材的准备17-18
• 2.2.2 软骨细胞原代分离培养18
• 2.2.3 软骨细胞传代培养及鉴定18
• 2.2.4 CCK-8 法检测细胞存活率18-19
• 2.2.5 Annexin V-FITC/PI荧光染色观察各组细胞凋亡19
• 2.2.6 RT-PCR检测Bax， Bcl-2 及MMP3，MMP13m RNA表达19-22
• 2.2.7 Western-blot检测MMP3，MMP13蛋白表达22-24
• 2.3 统计学处理24-25
• 第3章 结果25-31
• 3.1 软骨细胞的形态及鉴定25-26
• 3.2 CCK-8 发测定细胞存活率26-27
• 3.3 Annexin V-FITC/PI荧光染色观察各组细胞凋亡27-29
• 3.4 RT-PCR检测各组细胞Bax，，Bcl-2,MMP3,MMP13m RNA表达情况29-30
• 3.5 western blot检测各组细胞MMP3,MMP13蛋白表达情况30-31
• 第4章 讨论31-33
• 第5章 结论33-34
• 致谢34-35
• 参考文献35-37
• 攻读学位期间的研究成果37-38
• 综述38-45
• 参考文献43-45

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本文编号：635590