沉默TRPV1基因对利多卡因所致细胞凋亡的影响及其机制

发布时间：2017-08-23 02:34

  本文关键词：沉默TRPV1基因对利多卡因所致细胞凋亡的影响及其机制

  更多相关文章： 利多卡因 瞬态电压感受器阳离子通道 钙超载 凋亡

【摘要】：目的:构建针对人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒表达载体,感染U87-MG细胞,观测其沉默TRPV1基因的效果。通过沉默TRPV1基因观测利多卡因处理后对U87-MG的细胞状态和凋亡情况的影响,以探讨利多卡因是否通过TRPV1产生神经毒性损伤。方法:利用Ambion在线设计软件设计针对人TRPV1基因的sh RNA干扰序列,克隆到p SUPERretro-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后采用荧光定量PCR及Western blotting法检测TRPV1表达。U87-MG的细胞分为空白对照组、基因沉默组以及空载体组。对于每个组的细胞,我们利用流式细胞技术,研究利多卡因处理后不同时间点的细胞内钙离子浓度及线粒体膜电位情况。并通过MTT方法和流式细胞术,检测U87-MG细胞的活力和凋亡情况。结果:经DNA测序和酶切鉴定表明,p SUPERretro-puro TRPV1表达载体构建成功。p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显降低。U87-MG细胞活力随着利多卡因处理浓度增高而降低。利多卡因处理各组细胞后随着时间增加,细胞内钙离子浓度逐渐上升。TRVP1基因沉默组的各时点钙离子浓度显著比其他各组低(P0.05)。利多卡因处理后,对照组U87-MG细胞的线粒体膜电位明显下降,而在TRVP1基因沉默组线粒体膜电位较高(P0.05)。同时,流式细胞结果显示,利多卡因处理后,各组的细胞凋亡增高,而在TRVP1基因沉默组则明显低于对照组(P0.05)。结论:成功构建了针对人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1表达载体。p SUPERretro-puro TRPV1能有效下调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达。利多卡因可导致U87-MG细胞内钙离子浓度增高,线粒体膜电位降低和细胞凋亡增多。同时,沉默TRPV1基因可降低利多卡因的这些损伤作用。这提示TRPV1与利多卡因神经毒性损伤机制有关。利多卡因可能通过激活TRPV1通道蛋白来增加细胞内钙离子浓度,降低线粒体膜电位并介导细胞凋亡。
【关键词】：利多卡因 瞬态电压感受器阳离子通道 钙超载 凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 前言10-12
• 第2章 实验材料与方法12-23
• 2.1 实验材料12-14
• 2.1.1 逆转录病毒及细胞来源12
• 2.1.2 主要试剂12-13
• 2.1.3 主要实验仪器和设备13-14
• 2.2 实验方法与步骤14-22
• 2.2.1 制备主要试剂14-15
• 2.2.2 细胞培养15
• 2.2.3 shRNA干扰序列设计15-16
• 2.2.4 构建pSUPERretro-puro TRPV1表达载体16-18
• 2.2.5 细胞感染与筛选18-19
• 2.2.6 荧光定量PCR检测TRPV1表达19
• 2.2.7 Western blotting检测TRPV1表达19-20
• 2.2.8 细胞实验20-22
• 2.3 统计学分析22-23
• 第3章 结果23-30
• 3.1 重组载体及相应细胞株构建的结果23-25
• 3.1.1 重组质粒测序的结果23-24
• 3.1.2 荧光定量PCR检测转染细胞TRPV1 m RNA的表达24
• 3.1.3 Western blotting检测转染细胞TRPV1蛋白的表达24-25
• 3.2 TRPV1低表达对利多卡因所致细胞凋亡的影响25-30
• 3.2.1 利多卡因处理后细胞抑制率的结果25-26
• 3.2.2 利多卡因诱发细胞内钙离子浓度变化26
• 3.2.3 细胞线粒体膜电位变化26-27
• 3.2.4 细胞凋亡结果27-30
• 第4章 讨论30-33
• 第5章 结论与展望33-34
• 5.1 结论33
• 5.2 展望33-34
• 致谢34-35
• 参考文献35-38
• 攻读学位期间的研究成果38-39
• 综述 局部麻醉药神经细胞毒性作用机制研究进展39-43
• 参考文献41-43

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 裴术丰,郭文新,聂珍静;口服利多卡因快速缓解胃部疼痛50例[J];中原医刊;2002年08期

2 赵广惠 ,商延贞;利多卡因的应用进展[J];现代中西医结合杂志;2002年09期

3 张广东;利多卡因致过敏1例[J];皮肤病与性病;2003年01期

4 袁利,侯玉华;利多卡因治疗椎基底动脉供血不足的疗效观察[J];河南实用神经疾病杂志;2004年01期

5 马传新,岳旺;利多卡因对电点燃模型的作用研究评价[J];药学实践杂志;2004年05期

6 王效德,杨建刚,常方成,靳素珊,张霞;利多卡因的临床新用途[J];齐鲁护理杂志;2004年12期

7 宫云娟;利多卡因的临床新用途[J];中国社区医师;2005年09期

8 杨弋弋;孙勃;;利多卡因在绝经后妇女取环术中的应用[J];中国社区医师(综合版);2005年19期

9 宋萍萍;王东信;王沛钰;;利多卡因对不同载脂蛋白E基因型小鼠短暂全脑缺血后脑损害程度的影响[J];中华医学杂志;2005年48期

10 陈华;;利多卡因的临床新用途[J];海峡药学;2006年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 徐慧琴;俞凤;高世明;;利多卡因对特发性室性心动过速的治疗(附33例临床分析)[A];中华医学会急诊医学学会第六次全国急诊医学学术会议论文汇编[C];1996年

2 许樝;欧册华;黎昌强;陈德宇;;静脉利多卡因治疗带状疱疹后遗神经痛[A];2009全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2009年

3 伍锟;季龙振;;利多卡因中药联合灌肠治疗慢性肾功能衰竭[A];第六届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2000年

4 偠麟;;利多卡因在治疗耳鸣疗效中的观察[A];第二十一届航天医学年会暨第四届航天护理年会论文汇编（下册）[C];2005年

5 张保华;宋敏;;利多卡因穴封治疗脑卒中顽固性呃逆临床观察[A];中国特种针法应用与针灸临床学术交流大会论文集[C];2000年

6 李德联;;大剂量利多卡因致呼吸停止1例[A];中华医学会急诊医学分会复苏、灾害、中毒专业联合学术交流会资料汇编[C];1999年

7 李新友;屠伟峰;;利多卡因对缺血再灌注过程中中性粒细胞的影响[A];2006年中华医学会全国麻醉学术年会知识更新讲座[C];2006年

8 周欢欢;凌晓飞;王秋惠;;利多卡因凝胶辅助留置导尿减少术后躁动的观察[A];中华护理学会第15届全国手术室护理学术交流会议论文汇编[C];2011年

9 赵勇;惠雅琳;宋发俊;;利多卡因单用与合用川芎嗪注射液治疗眩晕的观察[A];第三届全国中西医结合神经系统疾病学术会议论文集[C];2000年

10 尉志文;，

本文编号：722522