重组腺病毒介导HLA-G基因转染恒河猴树突状细胞对T细胞增殖的作用

发布时间：2017-08-24 04:44

  本文关键词：重组腺病毒介导HLA-G基因转染恒河猴树突状细胞对T细胞增殖的作用

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【摘要】：[目的]将介导HLA-G基因的重组腺病毒转染恒河猴未成熟树突状细胞,鉴定基因进入细胞中并稳定表达；探讨恒河猴HLA-G重组腺病毒载体感染的恒河猴imDC对刺激T细胞增殖的作用。[方法]使用氯胺酮麻醉恒河猴,用穿刺针穿刺恒河猴髂后上嵴。待获得新鲜的骨髓血后置入冰盒低温保存。猴淋巴细胞分离液能够有效分离单个核细胞与骨髓血中的其他细胞,免疫法获得纯度较高的CD34~+细胞。在体外成功获取大量DC的关键则是添加两种小剂量的细胞因子,即GM-CSF联合IL-4。因此通过添加RPMI1640培养基给予细胞营养进行体外培养的同时添加两类细胞因子,诱导CD34~+细胞分化。用细胞计数板计数生长良好的imDC,按细胞数量接种于细胞培养板的不同培养孔中,同时根据不同MOI值分别加入腺病毒病毒液,同时添加细胞因子和培养基,48小时后观察细胞绿色荧光色素蛋白的表达情况。HLA-G重组腺病毒感染imDC,成功提取蛋白后,运用Western Blot检测技术检测目的蛋白表达的情况,对腺病毒感染imDC组和阴性对照组的灰度值比较分析。以刺激细胞和反应细胞来进行细胞混合淋巴细胞反应,根据不同的细胞组合和培养方式,将刺激细胞分为5组,各组分别进行诱导培养。各刺激细胞组分别依次刺激T细胞,按照不同的刺激细胞：反应细胞比例,获取各组的刺激指数(stimulation index, SI)。运用统计学软件分析各组刺激T细胞增殖的作用。[结果]免疫磁珠法获得纯度较高的CD34~+阳性细胞,进而运用细胞因子联合诱导获得imDC。当MOI不同的情况下,重组腺病毒介导HLA-G,成功转染了生长良好的imDC,载体在imDC中的稳定表达。Western blot检测发现,出现的特异性条带与HLA-G表达的蛋白大小一致,在36kD见GADPH内参蛋白表达,两组重组腺病毒感染组较阴性对照组表达水平上升85.77%和86.57%,推断表明HLA-G基因进入恒河猴imDC,在imDC中稳定表达。混合淋巴细胞培养,通过配对t检验分析得出结论：重组腺病毒感染imDC处理组对刺激T细胞增殖的能力显著降低。[结论](一)重组腺病毒介导HLA-G基因转染恒河猴imDC, HLA-G在imDC中稳定表达；(二)LPS诱导的炎症条件能够促进imDC成熟,增强DC的抗原呈递作用,促进T细胞增殖；(三) HLA-G能够有效抑制恒河猴T细胞的增殖,同时也能在炎症条件下抑制T细胞增殖。
【关键词】：HLA-G基因 肝移植 免疫耐受 恒河猴
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-20
• 实验方法20-33
• 结果33-45
• 讨论45-50
• 结论50-51
• 参考文献51-57
• 综述57-66
• 参考文献62-66
• 攻读学位期间获得的学术成果66-67
• 致谢67

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本文编号：729275