构建NT-3交联脱细胞脊髓支架缓释系统及研究其体外实验
本文关键词：构建NT-3交联脱细胞脊髓支架缓释系统及研究其体外实验
更多相关文章： 脊髓损伤 脱细胞方法优化 NT-3交联脱细胞脊髓支架 缓释系统 生物活性 骨髓间充质干细胞 粘附性 增值性
【摘要】：背景:近年来,为了治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI),组织工程学,通过支架材料复合种子细胞,额外添加营养因子,对脊髓再生进行重构,从而促进其功能恢复。其中支架材料可以提供适宜微环境和一定的机械支撑,促使种子细胞的粘附、生长,在组织工程修复中具有相当重要作用。目前常用的脊髓支架材料,如:透明质酸、PLGA丝蛋白-壳聚糖复合支架材料等。虽然以上材料具有各自独特的优点,但是它们不具备脊髓特有结构,如微观三维网状结构,因此在脊髓修复重建中有局限作用。前期研究,脊髓组织被脱细胞,得到ECM三维空间结构,胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等被保留,即脱细胞脊髓支架材料。但前期的脊髓脱细胞方法尚不稳定,主要表现在脱细胞彻底而细胞外基质保留不完整,或者细胞外基质保留完整而脱细胞不彻底,此外脱细胞脊髓支架复合种子细胞后还遭遇神经营养因子匮乏的难题。因此,进行一下研究:(1)脱细胞方法被优化,支架的制备过程被稳定化;(2)并采用化学交联的方法结合神经营养因子-3(NT-3),使NT-3交联脱细胞脊髓支架的缓释系统具有缓释活性作用;(3)NT-3交联脱细胞脊髓支架复合种子细胞后具有独特的作用,可以促进种子细胞粘附、增殖等。目的:1.脱细胞方法被优化,脊髓ECM结构被保留,细胞被彻底去除。2.采用碳化二亚胺(EDC)化学交联的作用,将NT-3结合到脱细胞脊髓支架上,制备NT-3交联脱细胞脊髓支架的缓释系统,分析该缓释系统NT-3的缓释性、缓释NT-3的生物活性。3.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)被复合NT-3交联脱细胞脊髓支架上,支架对BMSCs粘附、增殖的影响。方法:1.传统法和优化法,制备脊髓支架,采用肉眼观察、扫描电镜、光镜、冻干、称重、酶解等技术对比研究支架的特性。2.elisa法被用来检测nt-3缓释性,缓释nt-3的生物学活性被e18孕鼠体内胚鼠的背根神经节验证,nt-3交联脱细胞脊髓支架整体蛋白分解性被bca蛋白测定法检测。3.对bmscs进行复苏、培养、传代等操作,得到p3代bmscs,复合到脱细胞脊髓支架和nt-3交联脱细胞脊髓支架后,共培养4小时后采用dapi检测bmscs在不同支架的粘附性;在不同的时间点,如共培养24小时、48小时后,不同支架对bmscs增殖的影响被cck-8检测。结果:1.优化组制备的支架“优”等级为80%,he评分“优”等级的支架经过dapi染色,激光共聚焦显微镜检测,内部结构脱细胞彻底,评分也为“优”等级;电子显微镜扫描可见三维网状结构,孔径平均为31.02um,含水率为(228.14±19.39)%,孔隙率为(71.82±2.10)%;在4、8、12、16、20小时不同时间段的抗酶解性为(8.268±1.229)%、(16.16±1.568)%、(23.5±2.252)%、(28.582±2.243)%、(35.904±1.911)%。优化组支架脱细胞彻底,制备效率高,孔径与传统组支架相当,但是含水率、孔隙率、抗酶解性均优于传统组支架。2.脱细胞脊髓支架与nt-3通过edc交联,nt-3交联脱细胞脊髓支架被成功构建,采用elisa法测定nt-3在不同时间段的缓释量,缓释性可达35天,在1、4、7、14、21、28、35天时间段的nt-3缓释浓度分别为(480.52±69.88)pg/ml、(111.43±5.34)pg/ml、(66.11±17.99)pg/ml、(121.35±7.85)pg/ml、(61.34±9.88)pg/ml、(36.22±16.37)pg/ml、(29.95±12.95)pg/ml;翻倍提高nt-3浓度后,采用背根神经节法验证缓释nt-3的生物学活性,第一天nt-3缓释液可以促进(72.00±8.19)根神经突生长,第四天为(32.67±8.14)根,第七天为(10.33±2.52)根,第十四天为(31.67±8.96)根,二十一天为(8.33±3.79)根,二十八天为(5.00±1.00)根,三十五天为(4.67±1.53)根,阴性对照为(9.00±2.00)根,阳性对照为(93.67±33.23)根。其中低于阴性对照组的是二十八天、三十五天、二十一天结果;在培养基中,被分解的nt-3交联脱细胞脊髓支架整体蛋白,经bca蛋白浓度测定试剂盒测定,在1、4、7、14、21、28天的不同时间段内缓释的蛋白浓度均低于0.2ug,证明被加入培养基条件下,nt-3交联脱细胞脊髓支架可以保留28天。3.3.7×105/ml,40ul大鼠骨髓间充质干细胞悬液被后复合nt-3交联脱细胞脊髓支架后,4小时细胞粘附数量为(109±5)个,优于交联支架(46±19)个;浓度为1.0×105/ml,10ul大鼠骨髓间充质干细胞悬浮液,与不同组支架共培养24小时和48小时后,nt-3交联脱细胞脊髓支架均有利于大鼠骨髓间充质干细胞增殖。结论:1.脱细胞法被成功优化,细胞成分被较彻底地去除,脊髓ECM三维空间结构被较完整地保留,各项指标如“优”等率、孔隙率、含水率、酶解率优于传统制备支架。2.NT-3交联脱细胞脊髓支架在ELISA法检测下,NT-3缓释性可达35天;缓释NT-3,具有生物学活性;经BCA蛋白测定法,NT-3交联脱细胞脊髓支架,在培养箱中,加入培养基,可以保留28天。3.BMSCs被NT-3交联脱细胞脊髓支架复合,相比于脱细胞脊髓支架,具有促进BMSCs粘附、增殖的作用。
【关键词】：脊髓损伤 脱细胞方法优化 NT-3交联脱细胞脊髓支架 缓释系统 生物活性 骨髓间充质干细胞 粘附性 增值性
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R651.2
【目录】：
- 缩略语表4-5
- 英文摘要5-9
- 中文摘要9-12
- 第一章 前言12-14
- 第二章 大鼠脱细胞脊髓支架制备方法的优化14-26
- 2.1 材料与方法14-18
- 2.2 结果18-23
- 2.3 讨论23-25
- 2.4 小结25-26
- 第三章 制备NT-3 交联脱细胞脊髓支架及其缓释性研究26-37
- 3.1 材料与方法26-30
- 3.2 结果30-34
- 3.3 讨论34-36
- 3.4 小结36-37
- 第四章 NT-3 交联脱细胞脊髓支架对大鼠骨髓间充质干细胞粘附和增殖影响的研究37-43
- 4.1 材料与方法37-39
- 4.2 结果39-42
- 4.3 讨论42
- 4.4 小结42-43
- 全文结论43-44
- 参考文献44-48
- 文献综述 组织支架修复脊髓损伤的研究进展48-54
- 参考文献52-54
- 攻读研究生期间发表的论文54-55
- 致谢55
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