高糖诱导髓核细胞凋亡的相关研究

发布时间：2017-09-16 17:12

  本文关键词：高糖诱导髓核细胞凋亡的相关研究

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【摘要】：研究背景及目的:细胞凋亡参存在于机体的整个生命过程,参与了生命过程中的各种生理及病理过程。细胞凋亡的增加或者减少是许多疾病的发病基础。目前研究发现,内质网除了参与机体正常的生命活动,也参与了细胞的凋亡过程,内质网凋亡途径成为新的凋亡通路。内质网凋亡通路的主要机制是各种理化因素导致的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。内质网在细胞生命过程中发挥重要作用,其主要功能是参与蛋白质的折叠、修饰及合成。当内质网受到内外理化因素刺激时,会导致蛋白质的代谢及合成障碍。当理化因素强烈、持续存在时,内质网稳态紊乱,积累大量的未折叠或折叠错误的蛋白质后,会激活内质网凋亡途径,进而导致细胞凋亡。当椎间盘髓核组织中髓核细胞大量凋亡时,即可引起椎间盘退变,进而导致一些列脊椎退行性疾病的发生。本研究旨在通将髓核细胞培养于含有高浓度葡萄糖的培养基中,探讨在高糖环境中,ERS是否参与诱导兔髓核细胞的凋亡过程。方法:本实验采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法,体外分离、培养兔髓核细胞,经过甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色后观察细胞形态。通过细胞免疫组织化学染色、免疫荧光染色鉴定髓核细胞后,将第三代兔髓核细胞随机分为四组,包括:对照组(正常培养基组)、高糖组(培养基中含有100m M葡萄糖)、Caspase-12抑制剂组(培养基中含有2μM氟甲基酮)和高糖+Caspase-12抑制剂组(培养基中含有2μM氟甲基酮及100m M葡萄糖),每组细胞按照不同的实验条件处理6h后,分别采用CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测各组细胞的增殖活性及凋亡情况,ROS检测试剂盒检测各组细胞内的总活性氧(reactive oxygen species,ROS),PCR和Western-blot检测各组Caspase-12和Grp78的表达变化。结果:成功完成了兔髓核细胞的体外分离培养;髓核细胞染色后镜下观察呈多角形、短梭形,有一到两个核仁,随着传代次数增加,细胞伸出伪足,胞体逐渐变细长;体外分离培养髓核细胞可稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。高糖组细胞增殖活性明显受抑制,细胞内ROS及凋亡率明显增加,Caspase-12和Grp78表达量较对照组明显增加;氟甲基酮可以降低高糖诱导的细胞凋亡率、Caspase-12及Grp78的表达。结论:1.ERS通过激活内质网Caspase-12凋亡通路参与了高糖诱导髓核细胞凋亡的过程;2.高糖诱导的ROS过量产生及积累是引起ERS的主要因素之一。
【关键词】：细胞凋亡 ERS Caspase-12 Grp78
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R681.5
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第1章 实验材料和方法9-19
• 1.1 材料9-10
• 1.1.1 实验动物9
• 1.1.2 实验试剂9-10
• 1.1.3 实验仪器10
• 1.2 实验方法10-19
• 1.2.1 兔髓核细胞体外分离培养10-11
• 1.2.2 制备细胞爬片11
• 1.2.3 髓核细胞鉴定11-12
• 1.2.3.1 髓核细胞的形态学观察11
• 1.2.3.2 髓核细胞苏木精-伊红染色11
• 1.2.3.3 髓核细胞甲苯胺蓝染色11
• 1.2.3.4 髓核细胞免疫组织化学染色11-12
• 1.2.3.5 髓核细胞免疫荧光染色12
• 1.2.4 实验分组12
• 1.2.5 细胞增殖活性检测12-13
• 1.2.6 细胞内总ROS检测13
• 1.2.7 细胞凋亡率检测13
• 1.2.8 荧光定量PCR检测Caspase-12和Grp78基因表达13-15
• 1.2.8.1 引物的合成13-14
• 1.2.8.2 Trizol法提取细胞总RNA14
• 1.2.8.3 应用Prime Script TM RT reagent Kit进行逆转录14
• 1.2.8.4 应用Light Cycler?480 System Real Time PCR扩增仪分析目的基因的表达14-15
• 1.2.9 蛋白印迹分析15-17
• 1.2.9.1 细胞总蛋白的提取15-16
• 1.2.9.2 蛋白浓度测定16
• 1.2.9.3 凝胶电泳16-17
• 1.2.9.4 转膜17
• 1.2.9.5 孵育抗体17
• 1.2.9.6 显影17
• 1.2.10 统计学分析17-19
• 第2章 实验结果19-28
• 2.1 兔髓核细胞体外分离培养结果19-20
• 2.2 兔髓核细胞鉴定结果20
• 2.3 细胞增殖活性检测结果20-22
• 2.3.1 各组髓核细胞吸光光度值（OD 值）见表 1.121
• 2.3.2 各组髓核细胞用不同培养基培养 6h 后，经 CCK-8 Kit 检测各组髓核细胞增殖活性见表 1.221-22
• 2.4 细胞内总ROS检测结果22-23
• 2.5 细胞凋亡率检测23-25
• 2.6 RT-PCT检测各组细胞Caspase-12和Grp78基因表达结果25-26
• 2.7 Western-blot检测各组细胞Caspase-12和Grp78表达结果26-28
• 第3章 讨论28-32
• 第4章 结论32-33
• 参考文献33-36
• 文献综述36-43
• 综述参考献41-43
• 攻读学位期间的研究成果43-44
• 致谢44-45

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李忠生;于常艳;陈宵;张斌;曹鹏;李斌;肖经纬;;喹乙醇致肾脏毒性的内质网应激相关凋亡途径研究[J];卫生研究;2015年03期

2 于占革;杨威;温莹;徐学振;魏伟;李念龙;;兔不同节段椎间盘髓核细胞培养特性的比较[J];中国脊柱脊髓杂志;2010年08期

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本文编号：864349