丝素蛋白骨科内固定材料研究

发布时间：2017-09-16 19:03

  本文关键词：丝素蛋白骨科内固定材料研究

  更多相关文章： 丝素蛋白 骨科内固定 生物可降解 生物相容性 生物力学

【摘要】：研究背景对于骨折的治疗,经历了由坚强固定到生物学固定的过程。骨折治疗理念的进步对骨内植物提出了新的要求。传统的钉板系统存在感染、应力遮挡、钉板移位以及主观疼痛或感觉异常等问题。大约12%颌面部骨折患者术后需要二次手术拆除内固定,随着可吸收高分子聚合物材料研究的发展,如聚乙酸,聚羟基乙酸,聚乙酸乙醇酸可吸收接骨板和螺丝钉的应用等均可降低二次手术的风险,并且可以逐渐把应力转移到愈合的骨头上从而促进骨再生。这些潜在的好处说明可吸收材料在治疗骨折时的乐观前景。但这些可吸收材料也存在触感明显,局部自限性炎症反应,感染和内固定需再次拆除等问题。丝素蛋白材料是美国FDA批准的,具有坚强的力学性能,良好的生物相容性的可降解生物材料,可以在超过170℃环境维持结构稳定,可以被高温高压灭菌,在极端pH值下也很稳定。根据既往文献报道丝素蛋白材料具有成为制备新型的医用可降解生物材料的良好潜能。但高强度的丝素蛋白材料制作过程包括各种化学试剂处理,通过温度、浓度等实验条件改变诱导丝素蛋白内部分子结构的排布,如从无规蜷曲转变为β折叠结构等,从而提高材料的强度,材料加工过程中不可避免的会加入有害化学试剂如甲醇,六氟异丙醇等,因此加工工艺是否会导致有害物质残留,相关物理化学性能改变而影响其良好的生物相容性和力学性能仍需要进一步研究。研究目的本研究以制备高强度、可吸收且具有良好生物相容性的丝素骨科内固定材料为目的,在文献学习的基础上摸索改进材料制备条件和工艺,详细探讨了新制备材料的基本性质,并从体外细胞形态观察,细胞毒性,细胞增殖,细胞凋亡,血液相容性等角度初步评价了丝素骨科内固定材料的体外生物相容性,为后期动物实验及临床应用提供依据。研究方法1.材料的制备：主要包括蚕丝脱胶、洗涤、干燥、蚕丝溶解、丝素混合溶液透析、溶液离心、冷冻冻干、再次溶解真空干燥的丝素纤维。丝素螺钉模具制作、甲醇置换、梯度换水、干燥、后期加工丝素螺钉及丝素固定板。2.材料的基本性质：通过生物力学机器测定三点弯,剪切力及弹性模量数据；通过接触角测量仪测定材料表面接触角；通过扫描电镜观察材料表面及横断面的微观结构,并用X线衍射仪及能谱分析仪检测材料表面的主要成分及元素组成；通过pHS-2C数字式酸度计测定浸提液的pH值；通过计算平衡盐溶液浸泡前后丝素蛋白骨科内固定材料重量的改变,材料直径的变化评价吸水膨胀性能；通过计算体外蛋白酶ⅪⅤ处理下不同时间点材料重量改变评价降解性能；通过螺钉植入家兔股骨中评价丝素蛋白骨科内固定材料术中的可植入性能。3.生物相容性试验：按照ISO 10993.12标准制备材料浸提液并培养细胞小鼠前成骨细胞,空白对照组采用含10%FBS的α-MEM培养基培养。采用钙黄绿素死活细胞染色、细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量测定判断有无细胞毒性,倒置显微镜观察与材料共培养(或者与材料浸提液共培养)的细胞形态,CCK-8法检测材料及其浸提液对细胞相对增殖率的影响,细胞凋亡实验评价材料对细胞凋亡和坏死过程的影响,溶血试验判断材料对血液红细胞有无溶血反应,根据上述结果综合评价丝素蛋白骨科内固定材料的生物安全性。研究结果1.材料的表征1.1 通过生物力学机器测定丝素圆柱棒最大剪切应力为42.6±13.5MPa。其抗弯强度达67.2±8.4MPa,弹性模量为8.1±1.1 GPa；与金属材料相比其弹性模量更接近骨骼本身的弹性模量；通过植入家兔股骨试验,共在12只家兔体内植入24枚螺钉,均成功植入,后期观察除了其中一只家兔右后腿跛行外,其余家兔行走均良好。前三个月标本取出后可见螺钉仍牢固固定在股骨干内,未发生脱出或移位等情况,材料与骨质接触表面良好,未见颜色改变等不良反应。1.2通过接触角测量仪测定材料表面接触角为95.8±8.5°,提示材料表面疏水。1.3电子扫描电镜观察材料表面均匀,结构致密。能谱分析仪结果提示该材料主要由碳、氮、氧、钙组成,其中碳元素原子百分比约为62.81%,氮元素约占14.69%,氧元素约占22.40%,钙元素约占0.1%。1.4丝素蛋白骨科内固定材料吸水膨胀性能：浸泡10min时材料重量已经开始增加,并且在2h开始,吸水速度开始增快,并且最终在PBS中浸泡48h后基本达到饱和,其最大吸水率达30.7±0.3%,后期随着浸泡时间延长,吸水率未发生明显改变。材料吸水后直径也随着浸泡时间延长而不断增加,其中直径增长速度也是在浸泡2h后开始增加,并在浸泡48h时间点附近直径增大最高达17.9±1.5%。1.5体外蛋白酶XIV降解试验提示材料的降解曲线拟合符合二阶函数规律,y=0.00087x2+0.2003x-0.495, R2=0.98,根据公式可以推导材料可在体外酶环境下降解3个月重量减少百分比为24.57%,体外完全降解需要8个月时间。1.6通过pHS-2C数字式酸度计测定浸提液的pH值可得到随着浸泡时间的延长,其PH值未发生明显波动趋势,最终稳定在7.0-7.2之间。2.材料的生物相容性2.1 细胞毒性试验：丝素蛋白骨科内固定材料浸提液与MC3T3-E1细胞复合培养24h后,LDH活性测定,材料浸提液组与空白对照组分别为(963.0±90.0)U/L,(882.4±106.0)U/L,两组数据之间无统计学差异(P0.05)；钙黄绿素死活细胞染色实验(绿染为活细胞,红染为死细胞)可见丝素蛋白骨科内固定材料周边细胞生长状态良好,细胞形体正常,铺展良好,高倍镜下可见细胞伸展性良好,未见明显死细胞。以上结果提示材料无明显细胞毒性。2.2 形态观察：丝素蛋白骨科内固定材料及其浸提液分别与MC3T3-E1细胞复合培养48h后,倒置荧光显微镜下观察材料及其浸提液培养的细胞贴壁良好,呈正常生长,形态呈梭形,胞浆内可见少量离散的黑色颗粒,未见明显细胞溶解等,符合0级标准。2.3 细胞增殖实验：细胞与材料共培养实验中,随着培养时间的延长,各组OD值逐渐升高,虽然不同时间点材料共培养组的OD值均低于空白对照组,且差异有统计学意义(P0.05)；而在细胞与材料浸提液共培养实验中,随着培养时间的延长,各组0D值逐渐升高,但实验组与空白对照组的OD值基本相等,未见统计学差异(P0.05)；2.4 细胞凋亡实验：丝素蛋白组坏死率为3.0%,凋亡率为2.3%；空白对照组坏死率为2.0%,凋亡率为2.9%；阳性对照组坏死率为3.5%,凋亡率为6.4%。材料共培养组与空白对照组的细胞凋亡率和坏死率没有显著性差异。说明丝素蛋白骨科内固定材料不会导致小鼠成骨细胞的凋亡或坏死。2.5 溶血实验检测丝素蛋白骨科内固定材料的溶血率为1.9%,其溶血率符合可植入医用材料的安全标准(5%)。结论1.本课题制备的丝素骨科内固定材料具有良好的生物力学强度,且与临床应用广泛的金属材料对比其弹性模量更接近骨骼本身的弹性模量,是一种新型的高强度可吸收生物材料,具有较大的临床应用价值。2.本课题制备的丝素骨科内固定材料吸水速率较慢,可满足临床医生术中操作要求；降解周期长,具有为骨折愈合提供良好固定的潜力。3.本课题制备的丝素骨科内固定材料表面具有疏水性,不利于细胞粘附；但材料周边细胞生长正常,与材料或其浸提液共培养均未见明显细胞毒性,材料不影响细胞增殖,对细胞凋亡未见明显不良影响。4.本课题制备的丝素骨科内固定材料溶血率低于5%,具有良好的血液相容性。因此本课题制备的丝素骨科内固定材料是一种生物相容性好,机械强度高,可缓慢生物降解,且降解产物不会对细胞机体产生不利影响的生物材料,具有容易植入,塑形良好,能在骨骼中保持8周以上的特征,所有这些特性都展示出其在生物医疗器械中的应用潜力。伴随着以后制备工艺的改进,材料表面涂层的研究,抗菌性能的添加等进步,丝素蛋白骨科内固定材料有望替代现有的可吸收骨科内固定材料而广泛应用于临床。
【关键词】：丝素蛋白 骨科内固定 生物可降解 生物相容性 生物力学
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R687
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 前言15-18
• 1.1 骨折治疗观念的转变15-16
• 1.2 丝素蛋白材料的应用现状16-17
• 1.3 本研究目的和主要内容17-18
• 第二章 丝素蛋白骨科内固定材料的制备及生物力学18-23
• 2.1 实验材料18-19
• 2.2 实验方法19-21
• 2.3 结果与讨论21-23
• 第三章 丝素蛋白骨科内固定材料的基本性质23-33
• 3.1 材料与方法23-25
• 3.2 结果与讨论25-30
• 3.3 小结30-33
• 第四章 丝素蛋白骨科内固定材料的生物相容性33-51
• 4.1 材料与方法33-41
• 4.2 结果与讨论41-47
• 4.3 材料对溶血实验的影响47-48
• 4.4 小结48-51
• 第五章 结语51-53
• 5.1 全文结论51-52
• 5.2 展望52-53
• 参考文献53-60
• 攻读硕士学位期间发表的论文60-61
• 致谢61-63

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