人脂肪源干细胞与纤维蛋白胶共混在裸鼠体内外的初步研究

发布时间：2017-09-19 04:11

  本文关键词：人脂肪源干细胞与纤维蛋白胶共混在裸鼠体内外的初步研究

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【摘要】：目的:掌握人脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的分离、培养方法,并探讨其部分生物学特性。探讨纤维蛋白胶对ADSCs增殖的影响。构建一种新型可注射型生物支架材料,为临床修复软组织缺损奠定实验基础。方法:1.取脂肪抽吸术的脂质部分,用酶消化法分离获得ADSCs。倒置显微镜下观察ADSCs体外培养形态学改变。利用MTT法检测原代细胞活性并绘制细胞生长曲线;第3代(P3)细胞分别加入含胰岛素、甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、吲哚美辛的条件培养基和含地塞米松、磷酸甘油、维生素C的条件培养基进行定向诱导分化成脂、成骨。油红O染色、茜素红染色定性,镜下观察ADSCs变化。2.体外培养人ADSCs,取P3细胞接种到96孔板,以不同浓度(纤维蛋白原与凝血酶比例:4∶1、2∶1、8∶3、5∶2)纤维蛋白胶浸润提取液培养,用MTT法检测ADSCs在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。3.体内实验分5组:A组:单纯纤维蛋白胶组,选用低浓度(纤凝比4:1)纤维蛋白胶;B组:单纯纯化后的脂肪颗粒组;C组:单纯ADSCs组,细胞浓度为3×106/ml;D组:细胞-脂肪复合物,细胞浓度为3×106/ml与纯化后的脂肪颗粒1:1混合;E组:细胞-支架复合物,细胞浓度为3×106/ml与纤维蛋白胶1:1混合。每组0.3ml分别注射至裸鼠背部皮下,5点/只,共10只。观察各组植入后,裸鼠的生命体征及局部变化,8周后取出,分别进行体积、湿重测定、HE染色等分析。结果:原代细胞显示3-4h开始贴壁,最初呈类圆形,2-4d逐渐延伸,呈典型成纤维细胞。5d左右进入对数生长期,2-3周单层细胞融合率可达90%左右,细胞排列紧密成旋涡状。传代后2-4h开始贴壁,增殖迅速,2-4d即可达80%。一般3-8代细胞增殖活跃,之后稍减弱。P3细胞分化成脂、成骨,油红O染色镜下可见细胞中间有脂滴,茜素红染色可见椭圆形结节状结构。不同浓度纤维蛋白胶制备的浸润提取液所培养的ADSCs生长曲线无明显差异。本次实验10只裸鼠,植入复合物后生命体征平稳,注射部位未见明显炎症反应,B、D、E组均可见新生组织形成,A、C组未见组织。大体观察,B组和D组可见明显脂肪颗粒,E组可见新生组织,但略少于B、D组。HE染色B、D、E组均可见脂肪细胞,D组富含胶原蛋白及脂肪颗粒。体积:D组B组E组;湿重:D组B组E组。结论:构建了一种简单有效的体外分离和培养ADSCs的方法,ADSCs生长旺盛、增殖快,具有多向分化潜能,可以作为组织工程理想的种子细胞。不同浓度纤维蛋白胶对ADSCs的增殖无明显影响,纤维蛋白胶有望成为ADSCs生长的支架材料。ADSCs能在纤维蛋白胶上黏附、生长,纤维蛋白胶可以作为ADSCs的载体和组织工程支架材料。
【关键词】：人脂肪源干细胞 细胞培养 可注射型支架材料 纤维蛋白胶 组织工程
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R622
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 前言10-12
• 第2章 材料与方法12-19
• 2.1 实验组织及动物12
• 2.1.1 实验组织12
• 2.1.2 实验动物12
• 2.2 主要仪器12
• 2.3 主要试剂12-13
• 2.4 主要试剂配制方法13-14
• 2.5 方法14-19
• 2.5.1 原代细胞的分离、培养14
• 2.5.2 细胞传代14-15
• 2.5.3 绘制细胞生长曲线15
• 2.5.4 诱导成脂、油红O染色15
• 2.5.5 诱导成骨、茜素染色15-16
• 2.5.6 纤维蛋白胶的制备16
• 2.5.7 纤维蛋白胶对ADSCs增殖影响的检测方法16
• 2.5.8 单纯纯化脂肪颗粒的制备16-17
• 2.5.9 细胞-脂肪复合物制备17
• 2.5.10 细胞-支架复合物制备17
• 2.5.11 复合移植物17
• 2.5.12 新生组织体积测定17-18
• 2.5.13 新生组织湿重测定18
• 2.5.14 HE染色18
• 2.5.15 主要观察指标18-19
• 第3章 结果19-26
• 3.1 ADSCS形态学表现19
• 3.2 ADSCS的传代培养19
• 3.3 细胞生长曲线19-20
• 3.4 油红O染色观察20-21
• 3.5 茜素红染色21
• 3.6 纤维蛋白胶浸润液对ADSCS增殖的影响21-22
• 3.7 注射植入物后裸鼠局部反应观察22-23
• 3.8 新生组织体积比较23
• 3.9 新生组织湿重比较23
• 3.10 新生组织HE染色23-26
• 第4章 讨论26-30
• 第5章 结论30-31
• 致谢31-32
• 参考文献32-35
• 攻读学位期间的研究成果35-36
• 综述36-46
• 参考文献43-46

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本文编号：879410