富氢培养液对脂多糖所致离体人肠上皮屏障功能障碍的影响及机制研究

发布时间：2017-09-19 10:39

  本文关键词：富氢培养液对脂多糖所致离体人肠上皮屏障功能障碍的影响及机制研究

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【摘要】：目的:脓毒症是由感染因素诱发并且以炎性反应为主的综合征,是烧伤、创伤和大手术等的常见并发症。肠上皮屏障能够阻挡微生物、毒素等透过肠壁进入人体内其他组织、器官以及血液循环。肠屏障功能障碍是脓毒症引发多器官功能障碍综合征(MODS)的重要因素。紧密连接蛋白occludin与黏附连接蛋白E-cadherin是肠上皮屏障的主要组成成分。内毒素脂多糖(LPS)通过改变紧密连接蛋白和黏附连接蛋白的正常表达,造成肠上皮屏障通透性增加,引发肠屏障功能障碍。多项研究已经证实氢气对多种脓毒症动物模型具有明确的保护作用,但是其具体机制尚未明确。本实验研究拟运用人结肠腺癌细胞系建立离体人肠屏障功能障碍模型,观察富氢培养液在调节LPS诱发的肠屏障功能障碍中的作用,并深入探讨其相关的作用机制。方法:人结肠腺癌细胞系Caco2复苏后传代培养至第28-35代之间时用于实验。第一部分:建立Caco2细胞单层模型。首先分别采用不同浓度的LPS(1,10,100μg/ml和1 mg/ml)孵育,于不同时间点(0,3,6,12,24,48 h)检测跨上皮电阻(TER)值和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖的渗透系数(PE)。采用CCK-8法测定100μg/ml和1 mg/ml的LPS对Caco2细胞增殖活力的影响。随机将细胞进行分组(4组):对照(control)组、富氢培养液(H2)组、脂多糖(LPS)组和LPS+H2组。按分组处理,于孵24 h时,分别检测TER值和PE。分别于孵育6、12和24 h时,采用Western blot法测定occludin与E-cadherin的表达水平;于孵育24 h时,采用免疫荧光法测定occludin与E-cadherin的分布情况。第二部分:首先按照第一部分的分组方法于孵育24h时,采用GST-Pulldown法测定Caco2细胞中Ras同源家族蛋白A(Rho A)的活性。细胞进行随机分组(5组):control组、LPS组、LPS+H2组、LPS+H 2+Rho A激动剂CN03(LPS+H2+CN03)组、LPS+Rho A抑制剂C3胞外酶(LPS+C3)组。Control组、LPS组以及LPS+H2组处理同第一部分。LPS+H2+CN03组中,于孵育前3 h时加入1μg/ml的CN03。LPS+C3组中,于孵育前1 h时加入2.5μg/ml的C3胞外酶。于孵育24 h时测定肠屏障模型的TER值与PE。分别采用Western blot法和免疫荧光法测定occludin与E-cadherin的表达与分布情况。第三部分:首先按照第一部分的分组方法于孵育24h时,Western blot法测定哺乳动物Diaphanous相关成蛋白1(m Dia1)的表达水平。慢病毒法转染Caco2细胞,对m Dia1进行RNA干扰,并获取稳定转染细胞株。将细胞随机分为5组:control组、LPS组、RNA干扰(si RNA m Dia1)组、LPS+H2组和si RNA m Dia1+LPS+H2组。其中,control组、LPS组和LPS+H2组处理同前;si RNA m Dia1组和si RNA m Dia1+LPS+H2组使用稳定表达m Dia1干扰片段的Caco2细胞。于孵育24 h时测定肠屏障模型的TER值与PE。分别采用Western blot法和免疫荧光法测定occludin与E-cadherin的表达与分布情况。结果:第一部分:与0μg/ml LPS组比较,100μg/ml和1 mg/ml的LPS孵育6-48h的时间范围内,TER值下降且PE均降低升高,趋势呈现出时间依赖性,并且在24 h时变化程度最为明显;100μg/ml LPS对细胞活力无显著影响,而1mg/ml LPS组中细胞活力显著降低。Control组与H2组比较,上述各指标间差异均无统计学意义。与control组比较,在LPS组孵育24 h时肠屏障模型的TER值降低,PE升高;孵育6-24 h时,occludin和E-cadherin的表达均下调;孵育24 h时,occludin和E-cadherin在细胞膜处分布减少,在细胞质中分布增多,“铁丝网”样形态的连续性与完整性破坏。与LPS组比较,LPS+H2组孵育24 h时肠屏障模型的TER值升高,PE降低;孵育6-24 h时,occludin和E-cadherin的表达均上调;孵育24 h时,occludin和E-cadherin在细胞膜处分布增多,在细胞质中分布减少,“铁丝网”样形态的连续性与完整性改善。第二部分:与control组比较,LPS组中Rho A活性升高;与LPS组比较,LPS+H2组中Rho A活性降低。与LPS+H2组比较,LPS+H2+CN03组中TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表达下调,且分布紊乱。与LPS组比较,LPS+C3组中,TER值升高且PE降低,occludin和E-cadherin的表达上调,分布情况改善。第三部分:与control组比较,LPS组m Dia1表达降低,LPS+H2组m Dia1表达升高。与control组比较,si RNA m Dia1组TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表达下调,且分布紊乱;与LPS+H2组比较,si RNA m Dia1+LPS+H2组TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表达下调,且分布紊乱。结论:富氢培养液能够改善LPS所致离体人肠屏障模型的通透性异常增加,并能调节紧密连接蛋白occludin和黏附连接蛋白E-cadherin的表达与分布,体现了肠屏障保护效应,其机制可能与调节Rho A-m Dia1通路的表达水平有关。
【关键词】：脓毒症 富氢培养液 脂多糖 肠屏障 Ras同源家族蛋白 A(RhoA) 哺乳动物Diaphanous相关成蛋白1(mDia1)
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-15
• 前言15-18
• 研究现状、成果15-17
• 研究目的、方法17-18
• 一、富氢培养液在调节LPS诱发离体人肠屏障功能障碍中的作用18-42
• 1.1 对象和方法18-28
• 1.1.1 实验细胞18
• 1.1.2 实验仪器与耗材18-19
• 1.1.3 主要试剂19-20
• 1.1.4 主要溶液配制20-21
• 1.1.5 实验方法与步骤21-27
• 1.1.6 统计学分析与处理27-28
• 1.2 结果28-36
• 1.2.1 不同浓度的LPS对离体人肠屏障TER值的影响28-29
• 1.2.2 不同浓度的LPS对离体人肠屏障渗透系数PE的影响29-30
• 1.2.3 不同浓度的LPS对Caco2细胞增殖活性的影响30-31
• 1.2.4 富氢培养液对LPS刺激离体肠屏障TER值的影响31-32
• 1.2.5 富氢培养液对LPS刺激离体肠屏障渗透系数PE的影响32-33
• 1.2.6 富氢培养液对LPS刺激所致occludin和E-cadherin表达水平变化的影响33-34
• 1.2.7 富氢培养液对LPS刺激所致occludin和E-cadherin分布情况的影响34-36
• 1.3 讨论36-40
• 1.3.1 肠道上皮屏障与脓毒症36-37
• 1.3.2 紧密连接蛋白与黏附连接蛋白37-38
• 1.3.3 氢气的治疗效应38-40
• 1.4 小结40-42
• 二、RhoA在富氢培养液改善离体肠屏障功能障碍中的作用42-54
• 2.1 对象和方法42-45
• 2.1.1 实验细胞42
• 2.1.2 实验仪器与耗材42
• 2.1.3 主要试剂42
• 2.1.4 主要溶液配制42
• 2.1.5 实验方法与步骤42-44
• 2.1.6 统计学分析与处理44-45
• 2.2 结果45-50
• 2.2.1 LPS和富氢培养液对Caco2细胞中RhoA活性的影响45-46
• 2.2.2 Rho A在富氢培养液改善LPS所致肠屏障TER值异常降低中的作用46
• 2.2.3 Rho A在富氢培养液改善LPS所致肠屏障PE值异常升高中的作用46-47
• 2.2.4 RhoA在富氢培养液改善LPS所致肠屏障紧密连接蛋白occludin和黏附连接蛋白E-cadherin表达水平异常降低中的作用47-48
• 2.2.5 RhoA在富氢培养液改善LPS所致肠屏障occludin和E-cadherin分布状态异常中的作用48-50
• 2.3 讨论50-52
• RhoA信号蛋白与肠屏障功能障碍50-52
• 2.4 小结52-54
• 三、哺乳动物diaphanous相关成蛋白 1（mDia1）在富氢培养液减轻LPS所致离体肠屏障功能障碍中的作用54-69
• 3.1 对象和方法54-59
• 3.1.1 实验细胞54
• 3.1.2 实验仪器与耗材54
• 3.1.3 主要试剂54
• 3.1.4 主要溶液配制54
• 3.1.5 实验方法与步骤54-58
• 3.1.6 统计学分析与处理58-59
• 3.2 结果59-65
• 3.2.1 LPS和富氢培养液对Caco2细胞中mDia1蛋白表达水平的影响59
• 3.2.2 慢病毒转染法对Caco2细胞中mDia1的mRNA表达水平和蛋白表达水平的影响59-60
• 3.2.3 mDia1信号蛋白在富氢培养液减轻LPS诱导TER值异常降低中的作用60-61
• 3.2.4 mDia1信号蛋白在富氢培养液减轻LPS诱导PE异常升高中的作用61-62
• 3.2.5 干扰mDia1信号蛋白的表达对富氢培养液减轻LPS诱导紧密连接蛋occludin和黏附连接蛋白E-cadherin表达水平异常降低作用的影响62-63
• 3.2.6 干扰mDia1信号蛋白的表达对富氢培养液减轻LPS诱导紧密连接蛋occludin和黏附连接蛋白E-cadherin分布状态异常作用的影响63-65
• 3.3 讨论65-68
• 3.3.1 Rho A/mDia1信号通路65-66
• 3.3.2 H_2对脓毒症相关信号通路的调节作用66-68
• 3.4 小结68-69
• 结论69-70
• 参考文献70-77
• 发表论文和参加科研情况说明77-79
• 综述 紧密连接蛋白在维持肠屏障功能中的作用与机制研究进展79-89
• 综述参考文献86-89
• 致谢89-91
• 个人简历91

【参考文献】

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1 吕宾;;肠黏膜屏障与肠功能障碍[J];现代消化及介入诊疗;2013年04期

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本文编号：881158