应用肥大化软骨细胞和海藻酸钠复合物栓塞治疗动静脉畸形的研究

发布时间：2017-09-21 00:31

  本文关键词：应用肥大化软骨细胞和海藻酸钠复合物栓塞治疗动静脉畸形的研究

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【摘要】：动静脉畸形(arteriovenous malformation,AVM)是一种常见的先天性血管发育异常,动静脉直接相通,其间无毛细血管,从而导致一系列血流动力学紊乱。常见于20~40岁的青壮年。目前,动静脉畸形的治疗方法主要包括外科手术、放射治疗以及血管内的介入治疗。随着科技的发展与进步,近年来血管内治疗由于具有创伤小这一显著特点,得到了较快的发展。血管内栓塞材料的不断开发和研究,使血管内栓塞治疗逐渐成为主要的治疗动静脉畸形的手段。而栓塞治疗的主要制约条件就是栓塞材料。目前国内外的栓塞材料主要包括颗粒栓塞材料、粘附性栓塞材料及非粘附性栓塞材料,这三类栓塞材料分别都有其不足之处。海藻酸钠是从海带中提取的天然聚合物多糖,具有良好的水溶性,与二价钙离子接触后,形成具有一定强度的海藻凝胶。具有良好的生物相容性,同时具有良好的弥散性,随着时间推移,逐步降解为无毒的多糖,随尿液排出体外。由于海藻凝胶具有降解的性质,不能永久保证栓塞的效果,我们把目光转向细胞与海藻凝胶结合,在海藻降解的同时细胞增殖,从而保证了长久的栓塞可能。目前主要的细胞来源为成纤维细胞及骨髓间充质干细胞:成纤维细胞来源丰富,增殖能力强,但其基质分泌能力较差,不利于细胞存活;骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能及良好的自我更新能力,但其含量较少,扩增不易。软骨细胞是软骨组织中特有且唯一的细胞,其具有一定的力学强度,能够分泌大量的基质成分,在缺氧的条件下能够生存。肥大化是软骨内骨化一个关键的生理步骤,肥大化软骨细胞逐渐骨化形成的钙化物可以进一步增大细胞的强度,同时肥大化软骨可以分泌VEGF等生长因子,促进细胞增殖和生长。因此,本实验中我们选择肥大化的软骨细胞与海藻凝胶结合形成复合物,作为治疗动静脉畸形的栓塞材料。在本实验中,我们采用兔肋软骨细胞原代培养分别得到1代、3代及5代的软骨细胞,通过测定细胞的生长速度,得到最适合实验的细胞代次,即第3代的软骨细胞,同时将细胞进行肥大化处理后的各个标志性基因进行鉴定。接着通过实验得出海藻酸钠及Ca Cl2的最适浓度,然后将肥大化的软骨细胞与海藻凝胶混合,得到海藻凝胶与细胞复合物,在体外培养1月后检测细胞存活率。之后将海藻凝胶-细胞复合物移植至裸鼠体内分析海藻凝胶-细胞复合物的稳定性。最后将海藻酸钠细胞混合物和Ca Cl2经双导管注入实验模型中,验证海藻凝胶-细胞复合物作为治疗动静脉畸形的血管内栓塞材料的可行性。本研究取得如下结果:1.成功分离了原代的软骨细胞,根据P1、P3及P5代次细胞的生存曲线状态,选定了P3代细胞作为细胞来源。2.P3代细胞进行肥大化处理后,其Ⅱ型胶原含量基本保持不变;同时,肥大化软骨细胞的标志性基因X型胶原开始出现,并随着肥大化进程逐步增多;细胞外基质分泌增多。3.选取了2%的海藻酸钠与6%的Ca Cl2为最适的浓度比例,并将细胞移植至海藻凝胶中,细胞在其中生存状况良好,显示了良好的细胞活力。4.将种植种子细胞的海藻酸盐-细胞复合物移植至裸鼠体内1个月,取材分析,海藻凝胶体积基本不变,同时裸鼠未见明显的炎症现象。5.初步制备了肾动脉栓塞模型,将海藻酸钠-细胞混合物与Ca Cl2同时注入兔肾动脉内,成功地栓塞了右侧肾动脉,超声及核磁共振检查显示,经过2个月的栓塞,右侧肾未见明显血流,同时伴有右侧肾脏的明显萎缩。以上研究结果为进一步探索动静脉畸形栓塞材料提供了初步的实验参考。
【关键词】：肥大化软骨细胞 海藻凝胶 栓塞材料
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R654.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-20
• 1.1 动静脉畸形11-13
• 1.1.1 动静脉畸形好发部位11-12
• 1.1.2 动静脉畸形的诊断方法12
• 1.1.3 动静脉畸形的治疗措施12-13
• 1.2 目前应用的栓塞材料13-17
• 1.2.1 固体栓塞材料13-14
• 1.2.2 粘附性液体栓塞材料14
• 1.2.3 非粘附性液体栓塞材料（沉淀聚合物）14-15
• 1.2.4 水凝胶栓塞材料15-17
• 1.3 种子细胞来源17-20
• 1.3.1 成纤维细胞17
• 1.3.2 骨髓间充质干细胞17-18
• 1.3.3 软骨细胞18
• 1.3.4 肥大化软骨细胞18-20
• 第2章 材料与方法20-27
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 实验仪器和设备20-21
• 2.1.2 实验试剂21
• 2.1.3 主要试剂的配制21-22
• 2.1.4 实验动物22
• 2.2 实验方法22-27
• 2.2.1 细胞分离和培养22-23
• 2.2.2 细胞生长曲线23
• 2.2.3 细胞肥大化诱导23
• 2.2.4 Alcian Blue染色23
• 2.2.5 细胞免疫荧光检测23-24
• 2.2.6 海藻凝胶的制备24
• 2.2.7 细胞活力检测24
• 2.2.8 RNA提取及RT-PCR24-26
• 2.2.9 裸鼠皮下移植26
• 2.2.10 兔肾动脉栓塞实验26
• 2.2.11 统计学分析26-27
• 第3章 实验结果27-36
• 3.1 软骨细胞生长状况27-31
• 3.1.1 P1、P3、P5代软骨细胞的生长曲线27
• 3.1.2 软骨细胞的肥大化诱导27-29
• 3.1.3 肥大化软骨细胞的鉴定29-31
• 3.2 海藻凝胶的浓度筛选31-32
• 3.2.1 海藻酸钠浓度的选定31
• 3.2.2 CaCl_2浓度的选定31-32
• 3.3 海藻凝胶-细胞复合物32-34
• 3.3.1 细胞在海藻凝胶中的状态32
• 3.3.2 海藻凝胶中细胞的活力检测32-33
• 3.3.3 海藻凝胶-细胞复合物的生物相容性检测33-34
• 3.4 兔肾动脉栓塞实验34-36
• 讨论36-38
• 结论38-39
• 参考文献39-44
• 作者简介44-45
• 致谢45

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本文编号：891321