肠三叶因子减轻烧伤内质网应激促进肠上皮细胞谷氨酰胺转运的机制

发布时间：2017-09-25 17:13

  本文关键词：肠三叶因子减轻烧伤内质网应激促进肠上皮细胞谷氨酰胺转运的机制

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【摘要】：研究背景及目的大面积严重烧伤除了引起皮肤损毁之外还可导致多种内脏功能严重受损,其中胃肠道是烧伤后受损最为严重的器官之一。烧伤后缺血缺氧性损害是导致胃肠道受损的首要原因,缺血缺氧不仅直接导致胃肠道组织结构受损,还可因缺氧造成的能量代谢障碍加重黏膜受损,抑制黏膜修复。相关研究表明,小肠所需的主要能源物质是谷氨酰胺(glutamine,Gln)而非葡萄糖。Gln能够促进肠黏膜修复,改善肠道功能。系列研究已证实,烧伤动物和患者给予Gln后能明显改善肠道能量代谢,促进ATP合成,进而减轻肠黏膜受损程度,促进黏膜修复,改善肠道功能。已有研究表明,严重创伤、感染及脓毒症等情况下,肠道对Gln的转运能力降低。烧伤属于严重创伤,有理由相信烧伤与创伤具有类似的病理生理变化。肠三叶因子(Intestinal trefoil factor,ITF)是杯状细胞分泌的肠道特异的生长因子,能减轻烧伤后肠黏膜损伤,但是否能改善烧伤后肠道对Gln的转运目前尚不清楚。本研究将着重探讨严重烧伤后肠上皮细胞对谷氨酰胺转运能力的变化规律以及ITF对其的影响,并探讨其分子机制。研究方法1.动物实验:将120只Sprague-dawley大鼠随机分为正常对照组(Control),烧伤对照组(Burn),烧伤+ITF治疗组(Burn+ITF)。所有大鼠均给予腹腔注射苯巴比妥钠(40mg/kg.weight)麻醉,然后皮下注射镇痛剂丁丙诺啡(0.05 mg/kg body weight),使用推毛机剃除背部和两侧体毛,露出30%体表面积以供烫伤。Control组大鼠置于37℃水浴中18秒模拟烫伤模型,其余各组大鼠置于97℃水浴中18秒制作30%体表面积Ⅲ°烧伤大鼠模型。伤后各组均立即腹腔注射乳酸林格液(40m L/kg.weight)复苏,烫伤大鼠置于烤温架待其苏醒,各组均给予正常饮食及饮水。Burn+ITF组于烫伤后6小时灌胃给予ITF(1mg/kg.d),其余各组灌胃等体积生理盐水。各组大鼠分别于烫伤后(post burn day,PBD)1、3、5、7天处死大鼠,取出小肠,提取大鼠小肠上皮细胞及其纹状缘囊泡。采用钙离子螯合法提取大鼠小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs),采用Mg2+低温差速离心法制备大鼠小肠纹状缘囊泡(brush-border membrane viscles,BBMVs),同位素计数法检测通过IECs和BBMVs的[3H]-glutamine的放射性强度,计算出IECs和BBMVs对[3H]-Gln的转运率。采用透射电子显微镜观察BBMVs的形态学变化,western blot检测大鼠IECs中Gln转运载体ASCT2,B~0AT1及其相关调控蛋白表达量的变化。2.细胞实验:体外培养大鼠小肠上皮细胞株IEC-6,采用10%烧伤大鼠血清培养IEC-6模拟细胞烧伤模型。实验分为正常对照组(Control),烧伤对照组(Burn),烧伤大鼠血清与ITF(10μg/m L)共培养组(Burn+ITF),烧伤大鼠血清+ITF(10μg/m L)+Compound C(10μmol/L)共培养组(Burn+ITF+Cp C),烧伤大鼠血清+ITF(10μg/m L)+3-MA(5mmol/L)共培养组(Burn+ITF+3-MA),烧伤大鼠血清+ITF(10μg/m L)+16F16(10μmol/L)共培养组(Burn+ITF+16F16)。采用同位素计数法检测通过IEC-6的[3H]-glutamine的放射性强度,计算出IEC-6对Gln的转运率,western blot检测IEC-6中Gln转运载体ASCT2,B~0AT1及其相关调控蛋白表达量的变化。实验结果1.严重烧伤后大鼠IECs和BBMVs对Gln的转运能力均明显降低,其中Na+依赖性转运载体介导的Gln转运降低的幅度更为明显,非Na+依赖性载体转运Gln的变化趋势除伤后1-3天外,其他时相点均明显高于伤前。2.正常大鼠肠上皮细胞转运Gln的部位主要位于纹状缘,大约占总量的65%。严重烧伤后该比例大幅下降。肠上皮细胞以及BBMVs对Gln的转运主要依靠Na+依赖性载体,该载体在肠上皮细胞以及BBMVs中介导的Gln转运量分别占总转运量的75%和85%,烧伤后该比例降至55%和60%,降幅均达25%左右。3.给予ITF能够明显促进烧伤后大鼠IECs及BBMVs对Gln的转运。在两型转运载体中,ITF主要影响Na+依赖型转运载体的活性,对非Na+依赖型载体的影响则不明显。ITF提高了Na+依赖型Gln转运载体的活性,进而提高了肠上皮细胞和BBMVs中该型载体转运Gln所占的比例。4.严重烧伤后,BBMVs空间结构严重受损,表现为形态极不规则,囊泡破损,泡壁塌陷,边缘毛糙,镜下可见诸多囊泡破损碎片;给予ITF 5天能够明显改善BBMVs形态,直至给药7天,其形态已接近正常,泡膜结构完整,泡腔饱满,整体轮廓清晰,但边缘仍显毛糙。5.严重烧伤后1-7天,大鼠IECs中Na+依赖型Gln转运载体ASCT2、B~0AT1蛋白合成量均明显降低,给予ITF能够明显促进ASCT2及B~0AT1合成,至给药7天,ASCT2、B~0AT1已基本恢复正常水平。6.严重烧伤后1-5天,大鼠IECs中内质网应激标志蛋白CHOP表达明显升高,PDI表达明显降低;给予ITF能够明显抑制CHOP表达,同时提高PDI表达水平。7.严重烧伤后,大鼠IECs中AMPK磷酸化水平明显降低,自噬水平升高;给予ITF能够上调AMPK磷酸化水平,自噬水平升高幅度更大。8.烧伤血清培养IEC-6细胞12h,ASCT2、B~0AT1、PDI蛋白水平和AMPK磷酸化水平均明显降低,同时,CHOP表达量、LC3-II/I值升高,IEC-6细胞对Gln的转运能力降低。给予ITF能够降低CHOP表达,增大LC3-II/I升高幅度,同时通过上调PDI、ASCT2、B~0AT1蛋白表达水平,促进IEC-6对Gln的转运能力。无论是抑制PDI,自噬,还是AMPK磷酸化,均可以抵消ITF对IEC-6细胞的生物学活性。结论1.大鼠肠上皮细胞及BBMVs对Gln的转运主要依靠钠依赖型载体,严重烧伤后,IECs及BBMVs中钠依赖性Gln转运明显降低。ITF能够通过促进IECs及BBMVs中钠依赖性Gln转运从而提高烧伤后大鼠肠上皮细胞对Gln的转运。2.ITF通过提高肠上皮细胞中钠依赖型Gln转运载体ASCT2、B~0AT1的蛋白表达水平,进而提高IECs对Gln的转运。3.ITF还通过维护烧伤后BBMVs的形态结构促进肠上皮细胞对Gln的转运。4.ITF通过上调烧伤后AMPK磷酸化水平,增强自噬,减轻内质网应激,维护PDI的含量,促进ASCT2、B~0AT1形成正确的空间结构,最终促进肠道对Gln的转运。
【关键词】：烧伤 谷氨酰胺 肠三叶因子 内质网应激 自噬 AMPK ASCT2 B~0AT1 PDI
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R644
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料与方法14-17
• 3. 实验方法17-21
• 4. 结果21-39
• 5. 讨论39-45
• 全文结论45-46
• 参考文献46-51
• 文献综述 自噬在维护肠道稳定中的作用51-60
• 参考文献55-60
• 在读硕士期间发表文章60-61
• 致谢61

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本文编号：918552